牛α—sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达.pdfVIP

遗 传 学 报．28(5)；405~410，2001 eta Gene斑 曲 牛 sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体 小基因在小鼠乳腺中的表达 谭晓红，程 萱，周 江，陈红星，林福玉，邓继先，杨 晓，黄培堂 幅：事医学科学院生物1-程研究所．北京 1130071) 摘要：将包括 刊酪蛋白基因的启动子、L虬蹦小基因、 1酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中，获得了5只转基因阳性鼠，其中1只转基因阳性雌鼠乳清中 LAtPA的台量为018 g／ml，说明构建的L P 小基因能够正确表达出有生物话性的LAtPA， 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。 关量词：组织型纤溶酶原激活剂；酪蛋白基因；转基因；小鼠；乳腺生物反应器 中圈分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2001)05-0405-06 组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶，是一种较为理想的血 栓溶剂。tPA在组织和体液中含量极微，从天然组织提取或人工合成药用tPA均不切实 际，惟有基因工程是合理途径。但原核表达系统无分泌功能，表达产物提纯困难；没有糖 基化和组装二硫键等功能，使表达产物水溶性差而且不稳定，大部分分子难以形成天然 tPA分子的空间构型，从而影响溶栓活性。采用哺乳类细胞做宿主生产药用tPA，虽使表 达产物避免了上述缺点，表达量却一直较低．维持费用高昂“】。转基因家畜的乳腺可作为 生物反应器来生产具有生物活性的多肽药物和具特殊营养作用的蛋白质。该系统具有能 够生产出完全生物活性的药用蛋白、纯化简单、投资少、成本低、对环境没有任何污染等优 点0】。为进一步探讨用转基因动物作为大量生产tPA途径的可能性，我们构建了由牛口-sl 酪蛋白基因调控序列和L P 小基因构成的乳腺表达载体，并通过显微注射法制备了转 基因小鼠，证实酪蛋白基因序列可指导LAtPA小基因在小鼠的乳腺中表达出有生物活性 的LAtPA。 1 材料和方法 1．1 材料 1．1．1 外源基因表达构件 从人血中提取人的基因组作为扩增 tPA的模板；LAtPA eDNA1 由刘士辉惠赠； sl酪蛋白载体由陈永福惠赠。 1．1,2 工具酶与试剂 所用限制酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自华荚公司； T4 DNA聚合酶 小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)购自Promega公司；KleilOW酶购自Biolalas 收稿日期：2000-08-14；修订日期：2001-01-05 基金项目：863基金赍助课题(z21-03-01) 作者筲什：谭晓~(1972)女，北京人．研究实习员，硕士学位，研究方向：转基因动物 E-mail：taawk@263．net 遗 传 学 报 28卷 公司；dNTP Set购自Pharmacia公司；蛋白酶K购自Memk公司。 1．1．3 试剂盒 Expand Long Template PCR System购自Boehringer Mannheim公司； QIApmp Spin Mimp~p Kit购 自QIAGEN公司；Wizard·DNA aean_up System购 自 Promega公司；Prime-e-Gene Labelling System购自Promege公司。 1．1．4 实验动物 清洁级昆明白小鼠，购白军事医学科学院动物中心，饲养于清洁级实 验动物房。 1．2 方法 1．21 tPA染色体组片段的获得 利用已知的人 tPA的序列(C．enBank No．I(03021)设 计PCR引物，上游引物5 一口11eCAG^AT兀’AA03GACGC 订G一3 ，位于人tPA基因组 的 17963～ 17987b口；下游引物 5 —A GTGCCCTCACCTGCAGTA--GTIGT一3 ，位于 23789~23765bp。用PCR试剂盒从人基因组DNA中扩增人的tPA从第二外显子到第六 外显子的片段。PCR扩增的循环条件为：94℃ 30s，65℃ 30s，68℃ 4min。循环数为3O，得 到约5．8kb的特异