蛋白质与酶学教学 蛋白质工程.pptVIP

第三章 蛋白质工程;一、蛋白质工程概念及原理;蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。 蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。 ;蛋白质工程的基本原理;二、改造现有蛋白质的步骤;三、常用技术;四、蛋白质改造包括的方面;增强蛋白质对胞内蛋白酶的抗性——简化纯化过程，提高产率； 改变酶的别构调节部位——减少反馈抑制，使产物的产率提高； 提高蛋白质的抗氧化能力； 根据需要改变酶的底物专一性； 改变蛋白质发生作用的种属特异性。 ;改进现有蛋白质的性状可以在基因水平上，也可以在蛋白质水平上。基因水平的改变：对编码蛋白质的基因进行改造，小到改变一个核苷酸，大到加入或删除某一结构域的编码序列。蛋白质水平的改变：对生产出的蛋白质进行各种加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。;五、经验性的规律;在设计突变时要保留pro和cys残基 Pro——终止α螺旋区； Cys——稳定二硫键；二硫键又是许多分泌性 蛋白的标志。;保留保守残基 保留潜在的N糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr-X-Pro）中的Asn、Ser或Thr。 含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，不会影响蛋白质其余部分的正确折叠。 两个同源蛋白的嵌合体：结合部位落在具有相同或相近功能的氨基酸序列中 两个非同源蛋白组成嵌合体：结合部分尽量位于所预测结构的边缘。 ;基因序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。 缺失突变：避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除，破坏正确的ORF，或缺失突变体边界不能落在适当的位置，而使蛋白质不能正确折叠。 ;六、基因诱变寡核苷酸介导的诱变(oliogonucleotide-directed mutagenesis)：是指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列。1.用M13DNA进行的寡核苷酸介导诱变寡核苷酸介导的诱变又称为定点诱变（site-specific mutagenesis）。必须先了解两个信息：1.要改变的基因编码区精确的核苷酸序列；2.要引入的氨基酸的变化。;常用的方法;例如：要把ATT(Ile)突变CTT(Leu)，当寡核 苷酸链大大多于M13DNA，而错配又位于寡核 苷酸链的中部时，在低温、高盐条件下二者 混合，就可以形成配对。;寡核苷酸介导诱变示意图;通过大肠杆菌dut-、ung-株系富集M13突变体示意图;2. 寡核苷酸介导的PCR诱变利用PCR进行定点诱变，可以使突变体大量扩增，同时也能提高诱变率。;通过PCR的寡核苷酸介导诱变示意图;Pfu-PCR直接诱变法示意图;3.改进型双引物诱变;4.重叠延伸诱变;5.DpnⅠ介导的诱变;DpnⅠ介导的诱变 M代表甲基化位点;6.简并寡核苷酸引物;7.随机诱变;定点诱变在蛋白质工程中的应用 一般来说，提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面： 1.延长酶的半寿期； 2.提高酶的热稳定性； 3.延长药用蛋白的保存期； 4.抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 问题：哪个特别重要重要？为什么？;蛋白质改造实例;将突变基因在大肠杆菌中进行表达，纯化突变蛋白，然后测定其酶活与热稳定性。 蛋白质的热稳定性通常用蛋白质总体结构的50%发生变性是的温度来表示， 蛋白质的变性程度由蛋白质在溶液中的圆二色性来测定。 ;T4溶菌酶及其6个突变体的性质;二.对酵母磷酸丙糖异构酶的改造在高温条件下，Asn→Asp,Gln→Glu，导致肽链局部构象发生改变，从而使蛋白质失活。;三.提高蛋白质热稳定性的其它方法 1.Gly没有β碳原子，Gly→Ala可以提高蛋白质的稳定性，这可能由于蛋白质从折叠状态下打开时减少了熵损失的缘故。导入Pro也有类似效果。 2.增加折叠蛋白质中稳定相互作用的数目，如谷氨酰胺合成酶，增加内部的疏水性氨基酸，即替换一个Gln。 ;3.把Asp、Cys和Met替换掉可以防止失活现象的发生，从而提高热稳定性。 如枯草芽孢杆菌中替换了六个氨基酸，每个 氨基酸替换可提高稳定性1.25-5.43kJ/mol,6 个同时替换，热稳定性则提高到15.884kJ/mol。 ;四.提高重组β干扰素的专一活性和稳定性人的β干扰素(IFNβ)的cDNA在大肠杆菌中表达，产物的抗病毒活性为106U/mg,只有天然糖基化蛋白的10%。;五.改进α1抗胰蛋白酶 α1抗胰蛋白酶——丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。 组成：由394个氨基酸组成，是一个糖基化的血清蛋白。 功能：抑制中性白细胞弹性硬蛋白酶的活性。 实例：该酶对肺造成损害，长期作用可能发展成肺气肿（肺不可逆地失