生物化学-王国丽-第14章 基因重组与基因工程.pptVIP

第十四章 基因重组和基因工程;自然界的基因转移和DNA重组是基因变异、物种演变和生物进化的基础。 对自然界基因转移和DNA重组的认识，启发人类发展了DNA重组技术。;第一节 自然界的DNA重组和基因转移是经常发生的（理解为主）;DNA重组;;一、同源重组是最基本的DNA重组方式 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组(general recombination)。 是最基本的DNA重组方式，通过配对、链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ; 内切酶 (recBCD);5′;片段重组体（图14-1右边产物，P347） ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。;二、细菌的基因转移与重组有四种方式;质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子;（二）转化和转导作用;;λ噬菌体的生活史;三、特异位点重组，即特异位点间发生的整合;H2鞭毛蛋白;V片段;四、转座重组;插入序列(insertion sequences, IS)组成 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 ;插入序列的复制性转座;（二）转座子转座;;第二节 重组DNA技术;相关概念;DNA克隆;基因工程(genetic engineering);一、工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;;;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶的发现;命名;细菌的限制修饰系统;;限制性核酸内切酶分类;三种限制性核酸内切酶的性质;Ⅱ类限制性核酸内切酶的特点;Bam HⅠ;Bam HⅠ;同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 ;同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;二、载体（Vector）;1. 质粒 (plasmid);;2. 噬菌体(phage);;3. 粘性质粒(cosmid);4.其他;三、重组DNA的步骤;重组DNA技术操作过程可归纳为;（一）目的基因的获取;1、化学合成法获取目的基因;2、从基因组DNA文库获取目的基因;限制酶切位点;3、从cDNA文库获取目的基因 ;mRNA ;4、PCR;PCR反应体系;PCR的基本反应步骤;PCR的基本反应步骤;;PCR的主要用途;几种重要的PCR衍生技术;（二）克隆载体的选择和构建;载体的选择标准;（三）外源基因与载体的连接;外源基因与载体的连接;1、粘性末端连接;双限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2、平端直接连接;目的基因;3、同聚物加尾连接;5′ 3′;4、人工接头(linker)连接;人工接头及其应用;（四）重组DNA导入宿主细胞;导入方式;（五）重组体的筛选;（1）抗药性标记选择;;（2）标志补救（marker rescue）;组氨酸缺陷 型大肠杆菌; α 互补的检测 ;（3）分子杂交法;原位杂交;鸡的β肌球蛋白的克隆和检出;（六）克隆基因的表达;表达载体pFASTBACI 的物理图谱;1、原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）;E.coli表达体系的不足;2、真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）;重组DNA技术操作过程;第三节 重组技术与医学的关系;主要应用领域; 重组DNA医药产品;基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的??陷，从而达到治疗的目的。;;基因诊断方法的标准;基因治疗的方式; 分子杂交与印迹技术;分子杂交与印迹技术的原理;复性;探针 (probe);印迹技术的类别及应用;三种印迹技术的比较;放射自显影照片;核 酸 序 列 分 析;核酸序列分析的基本方法;化学裂解法;DNA链末端合成终止法;;DNA自动测序;DNA自动测序结果举例;问题