生物化学教学资料 第十三章 基因工程.pptVIP

第13章 基因工程; 是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。 ; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;一、克隆载体和目的基因的制备;（一） 载体;2.分 类： (1)克隆载体(cloning vector):使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 (2)表达载体(expression vector):使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 常用载体：质粒、噬菌体、病毒;理想克隆载体的特征;质粒DNA的形态;质粒的复制类型;质粒功能分类; 噬菌体载体;病毒克隆载体 动物，植物，微生物 噬菌体克隆载体 细菌;（二）目的基因的来源;组织或细胞染色体DNA;mRNA ;基因组DNA文库; 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) ;美国科学家Kary. Mullis ;PCR的基本反应步骤; ??嘉韵黄石公园的热泉里发现的嗜热菌 ，成功分离出该细菌耐高温的TaqDNA聚合酶。 Mullis虽然提出将Taq DNA聚合酶应用到PCR的建议。 1986年6月，Saiki首度将其应用于PCR，效果就好得惊人，可以说是一炮打响。自此，PCR大获成功。 ;PCR的反应体系;salts (ions);PCR的基本反应步骤;95?C;PCR仪;PCR的主要用途; 限制性内切酶;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。; Ⅱ型限制酶识别序列特点—回文结构 ;EcoRⅠ;重播;粘性末端连接 ;Bam HⅠ切割反应;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;;;四、筛选和鉴定;α-互补（α-complementation）： 在T-vector或 PUC质粒序列中，插入了β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽）； 宿主菌（如JM、DH5α系列）β-半乳糖苷酶基因没有编码α-肽碱基序列，只有编码β-半乳糖苷酶C-端氨基酸的核苷酸序列; 空载体转入到宿主菌后，载体上的β-半乳糖苷酶N-端片端才能与宿主菌的C-端片段互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，这种作用称为α-互补。; 若载体中插入外源基因，将使lac Z基因N端序列无法表达，不能与宿主菌产生α-互补现象，当外源诱导物IPTG和人工底物X-gal加入后，底物不被转化，不能生成蓝色菌落，而保持白色。称为“蓝-白筛选”。;pUC18 2686bp;互补显色反应 ;(二)、酶切鉴定 (三)、核酸杂交 (四)、免疫鉴定 (五)、PCR/DNA测序鉴定 ;重组DNA技术操作过程可形象归纳为 ;五、目的基因的表达;基因SMARCAD1在指纹缺失的人身上发生了突变 ;;; 格拉斯哥大学的李-克罗宁从含有金属的大分子结构中形成类似细胞的泡沫，大分子是金属氧酸盐物质，其中包含钨、氧和磷。并赋予一些类似生命体的特性。目前他希望能够诱导这些“金属细胞”演变成为完全有自我繁殖能力的实体。