显微切片论文.doc

激光显微切割技术及其在植物细胞研究中的应用 激光显微切割(Laser mierodisseetion，LM或LMD)是显微观察和分子生物学研究之间的桥梁。它将在显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取出，从而与旁邻的其他细胞分开，并且可以将目标细胞放入试管中进行分子生物学的分析研究。 从激光类型和技术原理上分，目前主要存在基于近红外激光(810nm波长)的激光捕获显微切割和基于紫外激光(337~355nm波长)的激光显微切割两种。 一 激光显微切割技术 1 发展历史 利用激光分离细胞的研究开始得较早[1]，但是直到1996年基于近红外激光熔膜原理的激光捕获显微切割(laser capture mierodissection，LCM)成功应用于动物细胞的切割和DNA、RNA分析[2]后，这一技术才在生物研究中迅速发展并被广泛应用。而在植物研究中的成功应用，则又滞后了6年[3-4]。2003~2005年间，激光显微切割技术在植物研究中的应用逐渐发展，越来越受重视[5-7]。 2 LM的基础原理 激光捕获显微切割技术(LCM)是在组织切片上方悬着机械臂控制的收集管,收集管的塑料帽表面有一层乙烯乙酸乙烯酯(Ethylene Vinyl Acetate,EVA)的热塑膜,在显微镜下选择好目标细胞后,发射低能红外激光脉冲,瞬间升温使EVA膜融化与目标细胞黏合再迅速凝固。接着目标细胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并随着塑料帽一起移走。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上,分离的细胞就转移至离心管中,从而可以分析出目标细胞的分子生物学特征,用于进行后续研究[2, 8]。 激光显微切割技术(LMD)需要将标本切片装片在薄膜载玻片或者薄膜覆盖的玻璃载玻片上[9]。脉冲紫外激光(UV-A)通过物镜聚焦在切片上,沿着目标区域的边缘移动切割,使选择区域内的细胞脱离下来且周围组织完好[10]。 德国PALM公司出售的LMD系统采用的是倒置显微镜,切割后目标细胞群由激光微切割弹射系统(Laser Microdissection and Pressure Catapulting, LMPC)弹进放在样品之上的微型管中[11]。而德国Leica公司的Leica AS LMD采用的是正置显微镜,切割的组织细胞借助自身重力掉落至载物台下的微量离心管中,避免了污染[12]。 3 LM的优点 3.1 方法快速、简便、易行 激发激光、转运膜捕获目的细胞,一步完成,易掌握,易操作,有利于科研和临床诊断领域推广应用。与常规的显微切割技术相比避免了繁琐的操作以及无关细胞和碎片的污染。每片转运膜可经受1 000~3 000次激光脉冲,捕获6 000个以上的细胞。每次激发耗时不超过1秒[13],可在极短的时间内获得大量单一类型的细胞。 3.2 准确度高 激光定位的准确程度可以达到1μm,捕获点范围达到3~5μm,因而足以捕获单个细胞,同时还可以根据细胞的形状、大小调整激光束的功率和直径。 3.3 细胞形态保持完好 与手工显微切割对组织细胞研磨破坏不同,LM在显微镜直视下,使用多聚体膜捕获目的细胞,无损伤破坏,保持了其完整的组织形态,并在计算机上记录下被捕获前后的影像,既有利于保证捕获的准确性,也使实验结果更可信、更具说服力。另外,LM并未破坏切片中剩余组织,完全可以在分子水平对相邻细胞(群)进行对比分析研究,这是以往的显微切割方法所无法比拟的。 3.4 细胞内分子结构保持完整 转运膜轻微、短暂的温度变化对细胞内DNA、mRNA以及蛋白质均无损伤,热塑性粘合避免了分子间的交联反应,其良好的水溶性也保证了下一步提取DNA、mRNA以及蛋白质的顺利进行。 3.5 特异性强 LM可以从免疫组化染色[14]的组织切片中分离、纯化具有不同抗原表型的细胞群加以研究,大大地增加了取材的特异性、目的性。 二 激光显微切割技术在植物细胞研究中的应用进展 　　高等植物是一个复杂的有机体,每部分器官都是由一种或多种组织构成,不的组织包含各种各样的细胞,细胞进一步分化行使不同的功能,植物细胞共有40多种。取材于混合的异质组织进行细胞分析,其结果往往是数量较大的那几类细胞的综合平均值。为了研究某种细胞或组织的特殊功能,就必须对特殊的细胞类型进行单一分离和分析。近几年来,随着激光显微切割技术的进步,尤其是低能激光技术的发展,在植物研究中的应用更加广泛。它能够快速准确地将目标细胞或细胞群从活体植物组织中分离出来,用于后续的研究或进一步的活体培养。另外,激光显微切割技术与各种分子生物学研究方法的结合,使得对植物的生长发育过程中细胞功能和分化研究更加准确易行。 用于激光显微切割的植物组织制片技术的改进： 激光显微切割技术最初是从医学中发展起来的。而植物细胞与动物细胞相比有很大的差异,植物细胞具有的细胞壁和液泡,尤其是