IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用论文.docVIP

　　IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用论文 祝畅 刘志恒 张传汉 桂伶俐 姚文龙 【摘要】 目的：检测在缺氧缺糖环境中，IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株（INPCs）NFκB的活性、细胞存活及细胞损伤的影响. 方法: 在建立转染pcDNA3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的基础上，用MTT法检测缺氧缺糖处理3，6和9 h后两细胞株的存活率，用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6 h前后NFκB的活性，并测定缺氧缺糖6 h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量，用Hoechst33342染色观察细胞核的形态. 结果：转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs 中NFκB的活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs，缺氧缺糖6 h或9 h时.freeline the effect of mutated IκBα gene on immortalized neural progenitor cell strains (INPCs) in oxygenglucose deprivation. METHODS: After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs, the cells ic condition for 3, 6 or 9 h respectively. MTT staining edium easured after the cells ic condition for 6 h. The morphological change of tic condition for 6 h or 9 h, but there ic condition for 6 h, lactate dehydrogenase content in culture medium utated IκBα gene improves the cell survival rate of INPCs and lessens the cell damage caused by oxygenglucose deprivation. 【Key cells; NFkappaB inhibitor alpha; cell hypoxia 0 引言 我们实验室已成功构建了转IκBα突变型基因永生化大鼠神经前体细胞株（immortalized neural progenitor cell strain, INPCs）［1］，并证实该细胞株中IκBα突变型基因可下调NFκB的活性，使部分炎性细胞因子的表达减少. 由于NFκB的作用广泛且复杂，其活性的变化在不同细胞及不同刺激情况下所引发的效应不同［2］. 我们拟检测在正常及缺氧缺糖培养条件下，转染IκBα突变型基因及对照载体的INPCs 细胞存活及受损的情况，为进一步探讨IκBα突变型基因影响细胞活性的可能机制和转染IκBα突变型基因INPCs的应用前景奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，NFκB荧光素酶报告质粒6×κB由德国Heike L Pahl教授惠赠. DMEM/F12培养基, B27无血清培养添加剂, 脂质体lipofectamineTM2000（美国Gibco公司）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF)（英国Pepro Tech公司）； MTT，hoechst33342（美国Sigma公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；酶标仪（美国BioRad公司）. 1.2 方法 1.2.1 MTT法检测细胞存活率 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs置无血清培养基培养，培养基成分为：DMEM/F12培养基添加bFGF，EGF各20 μg/L，1×B27，青、链霉素各1×105 U/L，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔0.1 mL，每株细胞每板接种24孔，共种4板，置37℃ 50 mL/L CO2培养箱培养24 h后留一板作为对照组，其余3板作为实验组，将实验组培养液换为无糖Earles液后，利用三气水套式培养箱，充以N2，使O2浓度维持在30 mL/L，CO2浓度为50 mL/L，分别处理3，6和9 h，然后将4板的培养液均换为DMEM/F12培养基，加入0.02 g/L MTT 50 μL/孔，继续在37℃ 50 mL/L CO2条件下培养4 h，吸去上清液，加入150 μL/孔DMSO，震荡混匀，在酶标仪上测