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蓖麻粕中残留蓖麻毒素的ELISA检测 王宗义 贺平丽张丽英杨文军 李德发 (中国农业大学农业部饲料工业中心，北京 100094) 摘要本文建立了蓖麻粕中残留蓖麻毒素的夷心EusA捡测方法。蓖麻粕样品经p}r7．4PBs提取使蓖麻 毒素充分溶出后可直接用于EusA检测。在本文确定的实验务件下，蓖麻拍中杂质对蓖麻毒素的检测无显著影 n 1MPa处理卯mill的蓖麻柏中耒检出蓖麻毒素，并以此作为蓖麻粕的阴性对熙。对卖际样品进行了测定。 关键词蓖麻毒素EuSA蓖麻粕 蓖麻毒素是蓖麻粕中对动物危害最大的一种毒素。蓖麻粕必须脱毒才能作为饲料使用，给动物饲 喂未经脱毒或脱毒不完全的蓖麻粕会造成中毒。研究表明．用未脱毒蓖麻粕饲喂山羊，蓖麻毒素最先 使消化道和肾脏受到侵害，进而造成肝、脾和淋巴发生病变”J。对蛋鸡而言．饲喂未脱毒蓖麻粕， 则表现为脱毛、停产、机体消瘦和内脏器官病变”j。给猪饲喂含30％热喷蓖麻粕(脱毒不彻底)的 日粮，有胃底和肾出血及肝脏病变发生”1。蓖麻毒素的作用机制已经比较清楚，作为一种含有双链 的核糖体失活蛋白，首先通过B链的运载进入细胞，经过还原作用释放A链，A链是一种高活性的 N一糖苷酶，可从核糖体rRNA上脱掉一个腺嘌呤，从而中断蛋白质的合成”J。 关于蓖麻粕中蓖麻毒素的检测方法，有颜色反应法、红细胞凝集分光光度法”1和聚丙烯酰胺凝 胶电泳法”1，但前两者灵敏度和特异性不高，后者样品处理烦琐费时。迄今较为实用的检测蓖麻毒 素方法是与免疫相关的检测技术，如酶联免疫吸附测定”J、免疫层析技术”1和免疫传感器技术”1等。 近年来又发展了蓖麻毒素的质谱分析技术…J，虽然能给出更为确定的结果，但样品处理复杂，成本 高，也不适用于低含量蓖麻毒索样品的检测。 目前，脱毒蓖麻粕作为蛋白饲料在畜牧养殖业已有应用，但我国尚没有脱毒蓖麻粕产品的国家标 准或行业标准以及相应的毒素检测标准。蓖麻毒素的检测方法，国内研究较少。本文旨在提供一个简 便、快速可靠的蓖麻毒素检测方法，为规范行业市场和进一步改善蓖麻粕的脱毒工艺提供参考。 l材料与方法 1．1仪器和试剂 单克隆抗体和兔源抗蓖麻毒素多克隆抗体(防化研究院提供)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗 发展中心；少量蓖麻毒素标品按unJ．Y．(1986)“11的方法制备；其他试剂购自北京化学试剂公司。 1．2溶液配置 1．2．1 氢钠于蒸馏水中，定容至l000nd。 1．2．2封板液溶解1．og牛血清白蛋白和50¨LTw”n一20于100．oIlll抗体包被液中。 1．2．3 ·527· 箍营养与饲科研究进展 169氯化钠，o．49氯化钾于2000Illl蒸馏水中，用pH计校准溶液的pH值。 L 000“PBs中。 2．5洗板液(PBsT)溶解O．5InlTween一20于1 1．2．6底物溶液 o．05mol／L的柠檬酸溶液 底物溶液A(o|1moL，LpH5．0的磷酸盐一柠檬酸缓冲溶液)将48．51I】l 与51．5ndO．1moL／L的磷酸氢二钠溶液混合，用pH计校准溶液的pH值。 O．1 mol／L的硫代硫酸钠溶液。 l|缶用前取10ml底物溶液A，加入1．O丌d底物溶液B和10灿30％的过氧化氢。 1．3蓖麻粕阴性对照样品的制备 取适量待检蓖麻粕于高压灭菌锅中0．15MPa处理60min。 1．4蓖麻毒素提取液的制备 rnlPBs，于摇床上提取4h， 称取O，2—0．39经粉碎过40目筛的蓖麻粕于50血三角瓶中，加入25 用中速滤纸过滤于50lrII容量瓶中定容，用PBS冲洗三角瓶，过滤冲洗液，如此重复三次，最后用 PBs定容至刻度。用PBS稀释50一100倍用于测定。 1．5蓖麻毒素的EI腮A检测 将鼠源抗蓖麻毒素单克隆抗体用抗体稀释液稀释成浓度为2彬lnl，每孔100一，4℃冰箱包被过