第十三章-酶类药物的分析.ppt

酶类药物的分析 第一节 概述 第二节 酶类药物的鉴别与检查 第三节 酶活力测定方法 第四节 酶活力测定方法设计 第五节 典型酶类药物的检测 第一节 概述 在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡。 一、酶的特性 二、酶的分类 三、酶的化学组成 四、酶的催化反应机制 五、酶催化反应动力学 一、酶的特性 1．酶是高效催化剂。 2．酶对底物的结构具有严格的选择性。 （1）相对专一性： （2）绝对专一性: （3）立体异构专一性: 3．酶催化反应的反应条件温和。 4．酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。 二、酶的分类 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶（或称连接酶） 三、酶的化学组成 分为简单酶和结合酶两大类。 结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为“全酶”，才呈现生物催化活性。 结合酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 四、酶的催化反应机制 1．酶-底物复合物的形成 在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶-底物复合物，降低反应的活性能，使酶促反应顺利进行。 2．酶-底物复合物加速反应速率的原因 （1）定向作用与底物浓缩 （2）酶使底物分子变形 （3）酸碱催化 （4）共价催化 。 五、酶催化反应动力学 酶的活力单位 酶活性单位（U）是酶活性高低的一种量度，用U/g或U/ml表示。 酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化1μmol底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。 酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。 Michaelis-Menten快速平衡学说 底物浓度的增加，反应速度上升呈双曲线。 在低底物浓度时，反应速度呈直线上升，表现为一级反应。 在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现零级反应。 米氏方程 酶反应动力学方程式： V——反应初速度 Vm——最大反应速度 Ks —米氏常数，Ks=K－1/K1， Ks为ES的解离常数，表示酶与底物的亲和力。 Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度，即V=1/2 Vm时，Ks=[S]。 Briggs-Haldane稳态学说 ES的形成速度与ES的解离速度相等，达到动态平衡，即“稳态”，反应方程式： Km取代了Ks，当V=1/2 Vm时，Km=[S]。 Km也可表示为底物与酶的亲和力。 第二节 酶类药物的鉴别与检查 鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反应。 专用于酶的鉴别方法： 酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）。 沉淀试验：胃蛋白酶 动物试验：透明质酸酶水解粘多糖。 酶类药物的检查 酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有含量限度。 酶类药物的检查 （一）脂肪含量限度检查 检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪不得过规定的含量。 （二）其他酶类含量限度检查 胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶。 （三）大分子活性物质含量限度检查 胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量 每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。 糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。 用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度。 第三节 酶活力测定方法 固定时间法 连续监测法 （一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 直接测定法 偶联法 三联酶活测定 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 固定浓度法 一、固定时间法 在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量（或活力）。 [E]表示酶浓度，[P]为反应产物浓度，t 表示酶作用时间，K为常数。 注意事项 缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应。 注意事项： 1、底物饱和 2、时间 二、连续监测法 在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量。 （一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法 （一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法： 还原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有紫外吸收