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第十三章-酶类药物的分析概要
酶类药物的分析 第一节 概述 第二节 酶类药物的鉴别与检查 第三节 酶活力测定方法 第四节 酶活力测定方法设计 第五节 典型酶类药物的检测 第一节 概述 在生物体内,酶能降低生化反应活化能,加快可逆反应的进行速度,使之尽快达到平衡。 一、酶的特性 二、酶的分类 三、酶的化学组成 四、酶的催化反应机制 五、酶催化反应动力学 一、酶的特性 1.酶是高效催化剂。 2.酶对底物的结构具有严格的选择性。 (1)相对专一性: (2)绝对专一性: (3)立体异构专一性: 3.酶催化反应的反应条件温和。 4.酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。 二、酶的分类 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶(或称连接酶) 三、酶的化学组成 分为简单酶和结合酶两大类。 结合酶类中除含有蛋白外,还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质,二者结合起来,称为“全酶”,才呈现生物催化活性。 结合酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 四、酶的催化反应机制 1.酶-底物复合物的形成 在酶促反应中,反应底物首先与酶分子上活性部位结合,形成酶-底物复合物,降低反应的活性能,使酶促反应顺利进行。 2.酶-底物复合物加速反应速率的原因 (1)定向作用与底物浓缩 (2)酶使底物分子变形 (3)酸碱催化 (4)共价催化 。 五、酶催化反应动力学 酶的活力单位 酶活性单位(U)是酶活性高低的一种量度,用U/g或U/ml表示。 酶活力单位定义:在规定的条件下,每分钟能转化1μmol底物所需要的酶量,称一个酶的活力单位。 酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力,U/mg。 Michaelis-Menten快速平衡学说 底物浓度的增加,反应速度上升呈双曲线。 在低底物浓度时,反应速度呈直线上升,表现为一级反应。 在高浓度时,反应速度达到一个极限值,呈现零级反应。 米氏方程 酶反应动力学方程式: V——反应初速度 Vm——最大反应速度 Ks —米氏常数,Ks=K-1/K1, Ks为ES的解离常数,表示酶与底物的亲和力。 Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度,即V=1/2 Vm时,Ks=[S]。 Briggs-Haldane稳态学说 ES的形成速度与ES的解离速度相等,达到动态平衡,即“稳态”,反应方程式: Km取代了Ks,当V=1/2 Vm时,Km=[S]。 Km也可表示为底物与酶的亲和力。 第二节 酶类药物的鉴别与检查 鉴别方法常用蛋白质鉴别方法,如在碱性条件下的双缩脲反应。 专用于酶的鉴别方法: 酶活性试验:与特异性底物反应(胰蛋白酶)。 沉淀试验:胃蛋白酶 动物试验:透明质酸酶水解粘多糖。 酶类药物的检查 酶类药物是生化产品和微生物发酵产品,在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质,影响酶质量,需有含量限度。 酶类药物的检查 (一)脂肪含量限度检查 检查方法,乙醚浸提,干燥,精密称定,脂肪不得过规定的含量。 (二)其他酶类含量限度检查 胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶。 (三)大分子活性物质含量限度检查 胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量 每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。 糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸)的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。 用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯(N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester,ATEE)作底物,通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度。 第三节 酶活力测定方法 固定时间法 连续监测法 (一)、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法: 直接测定法 偶联法 三联酶活测定 (二)、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法: 固定浓度法 一、固定时间法 在适宜的条件下,使酶和底物共同保温一定时间,然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量(或活力)。 [E]表示酶浓度,[P]为反应产物浓度,t 表示酶作用时间,K为常数。 注意事项 缺点:无法了解整个反应过程是否都是零级反应。 注意事项: 1、底物饱和 2、时间 二、连续监测法 在酶反应过程中,连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量。 (一)、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法 (二)、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法 (一)、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法: 还原型辅酶(NADH和NADPH)在340nm处有紫外吸收
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