第十章 质谱法和生物质谱法.pptVIP

在Edman循环反应中，用含有5%异硫氰酸苯酯(PIC)的异硫氰酸苯酯作为Edman反应终止剂。反应中产生PTC-肽，还产生苯氨基甲酰肽（PC-肽）。PC-肽不能进一步发生环化裂解反应。经过数次循环降解后可得到有终止剂封闭N端产生不同长度的系列肽段衍生物的混合物，进行MALDI/MS测定，可由获得质谱图相邻各肽段衍生物产生的离子峰质量差依次流出N端氨基酸顺序。 氨基酸序列分析 方法二：利用蛋白质外切酶（亮氨酸氨肽酶，羧肽酶）降解，产生一系列肽段，获得质谱图相邻各峰之间质量差读出N端或C端顺序。 氨基酸序列分析 二、糖蛋白和寡糖分析 1 糖蛋白分析 分子量，含糖量和寡糖结构分析 2 糖蛋白结构分析难点 寡糖链不均一性 低离子化效能 确定糖基位点困难 二、糖蛋白和寡糖分析 1糖蛋白分子量：MALDI-TOF 2含糖量测定：内糖苷键酶切断糖苷键得肽链，可计算肽链分子量。 糖蛋白平均分子量-肽链分子量=含糖量/糖蛋白分子质量×100%。 3糖基化位点确定：采用蛋白酶酶解糖苷内切酶相结合，网上数据库检索，确定糖基化位点。 三、核苷酸分析 寡核苷酸样品用外切酶从3’或5’端进行部分降解，不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，计算被切割的核苷酸单体分子质量，将其与四个脱氧核苷酸标准分子量对照，读出管核苷酸序列。 1延迟离子引出技术 激光解吸电离离子延时一段时间引出，进入加速电场。 2酶解与质谱分析结合。 生命科学学院制药工程 第十章 质谱法和生物质谱法 质谱基本理论 1 生物质谱法 2 3 本章内容 第十章质谱法和生物质谱法 生物质谱法的应用 第一节 质谱基本理论 质谱原理：样品置于高真空中，受到高速电子流作用，使其失去外层电子而生成分子离子或化学键断裂生成各种碎片离子。引入加速电场加速，进入质量分析器，不同质荷比的各种离子具有不同速度，离子分别聚焦形成质谱图。 质谱仪： 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 记录质谱图 第一节 质谱基本理论 离子源 质量分析器 扇形质量分析器 飞行时间质量分析器 四极杆质量分析器 离子阱质量分析器 离子回旋共振质量分析器 第一节 质谱基本理论 质谱图：样品受到高速电子流冲击后，离子化形成的分子离子和碎片离子，按其质量m与电荷z比值m/z质荷比大小依次排列记录下来的图谱。 横坐标为质荷比，纵坐标为离子强度，以丰度表示。 相对丰度：以强度最大的峰为100作为标准峰，其它峰与标准峰比值。 绝对丰度：各离子峰高度占所有离子峰高度总和百分比。 第一节 质谱基本理论 乙酸乙酯 一、激光解吸离子化（LDI） 1 基质：选一种物质能吸收入射激光与待测物共存，这种物质称为基质，如烟酸， 2,5-二羟基苯甲酸（DHB） 2 原理：将待测物与基质结合，由于基质对激光较强吸收，虽然待测物对激光具弱吸收，当激光打在基质晶体时，聚集能量，加热晶体，快速加热导致基质晶体升华，将非挥发性待测物释放到气相中。 第二节 生物质谱法 3 方法 相对分子量1000左右，采用LDI/MS分析。 样品配制成溶液，滴加于不锈钢及惰性金属靶上，待溶剂挥发干，用质谱仪测定。 多肽、蛋白质、核苷酸、多糖等生物大分子采用MALDI/MS分析。样品配制成溶液与基质溶液混合，滴加于不锈钢靶上，质谱仪分析。 正离子谱，(M+K)+， (M+K)+，低质量区基质产生信号，高质量区蛋白质产生信号。 第二节 生物质谱法 二、电喷雾离子化质谱法（ESI/MS） 1 原理：毛细管出口处施加一高电压产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，加热使溶剂蒸发，液体体积缩小生成去溶剂化离子。 2 蛋白质、多肽主要为多质子化分子 3 正离子谱(M+nH)n+ 负离子谱(M-nH)n+ 第二节 生物质谱法 一、多肽和蛋白质分析 1 分子量测定 ESI/MS MALDI/MS 2 肽图谱及氨基酸序列分析 LC/MS 液相-质谱联用 肽图谱 MALDI/MS 氨基酸序列 第三节 生物质谱法的应用 方法一：对Edman降解反应的改进，用异硫氰酸苯酯（PITC）作为降解试剂。 1 首先PITC与多肽或蛋白质末端伯氨基发生偶联，生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-肽）。 2 PTC-肽在无水的酸性介质中发生环化并经重排而被裂解下来，得到不稳定的噻唑啉酮苯胺（ATZ）和减少一个残基的肽。 3 由于噻唑啉酮苯胺不稳定，在酸性水溶液中转化成稳定的苯乙内酰硫脲氨