第三节、生物活性试验.pdf

第三節、生物活性試驗 壹、細胞活性試驗 一、細胞存活率 (Cell survival)20-22 一般以細胞株進行藥物活性篩選時，須先進行細胞存活率試驗 (cell viability test)，以確定化合物對該細胞株是否有不良的反應或傷 害。常用的分析方法大約可分為cell proliferation assay、metabolic assay 及microtitration assay (MTT-based)等。 實驗室所採用的細胞存活率測試為MTT assay，其原理是因為活 細胞粒腺體內的琥珀酸脫氫酶 (succinate dehydrogenase)可將水溶 性黃色methylthiazoleltetrazolium bromide (MTT)還原成脂溶性的紫 色MTT formazan。而粒腺體是細胞內對環境因素最敏感的胞器，因 此其生理狀況可代表整個細胞的生理狀況，且只有活細胞中的琥珀酸 脫氫酶 才能將MTT 還原代謝，故以此分析法來評估化合物對細胞株 之安全性與相容性。 10 二、一氧化氮生成抑制(Inhibition of nitric oxide synthesis) 23-28 當生物體受到外來物質刺激時，體內會啟動防禦機制將外來物質 去活化或破壞，並促進受損細胞修補以保護生物體。主要機制是受損 之細胞與組織會釋出趨化性物質，使多核性白血球與單核球聚集受損 部位，而進行一連串之發炎免疫反應。其中單核球會轉化成巨噬細胞 並促使細胞膜上的phosphatidylcholine (PC)被phospholipase A2 水解 成花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，再經環氧化酶 ( cyclooxygenase, COX)與脂氧化酶 (lipooxygenase, LOX)的作用，產生大量的發炎因子- 前列腺素(prostaglandins, PGs)、白三烯素(leukotriene, LTs)、TXs 等 導致發炎現象的產生。而除了大量產生 PGs、LTs 外，亦會大量產生 一氧化氮(nitric oxide, NO )。 一氧化氮(nitric oxide, NO)為多功能的自由基，在體內代謝生成硝 酸鹽(nitrate)和亞硝酸鹽(nitrite)。NO 親脂性佳，可穿透生物體細胞膜， 調控多種生理功能，包括調節血管張力、心肌收縮力、抑制血小板凝 集及吸附、調節內皮細胞與淋巴球之間的作用、維持內皮細胞的完整 性及正常通透性，調控血管細胞的增生等，同時也與免疫功能有密切 關係。一氧化氮在生物體內的生合成是經由專一性合成酶 nitric oxide synthase(NOS)將L-arginine 轉化成NO 及L-citrulline。目前可將NOS 同功酶 大致分為兩種型態，即結構型(constitutive)及誘導型(inducible) 兩種：constitutive NOS(cNOS)，屬鈣離子/鈣調蛋白(Ca2+-calmodulin) 依賴性作用，主要分佈在內皮細胞及神經組織中。另一為 inducible NOS(iNOS)，在生理情況下其基因表現不明顯，屬非鈣離子/鈣調蛋白 依賴性作用，在輔因子tetrahydrobiopterin (BH4)和NADPH 參與下， 可持續合成 NO，主要存在於血管平滑肌及巨噬細胞中，可被內毒素 (lipopolysaccharide)、趨化素(5 及 12-HETE、LTB4)以及細胞激素 (cytokines)等活化，一般認為 iNOS 主要是協調免疫系統，對癌細胞 及外來細菌或病源體產生毒殺作用，故對生物體具有某種程度的保護 效果，但過度活化iNOS，也會造成細胞毒性及敗血性休克等嚴重的現 象。 11 本實驗室以內毒素(LPS)刺激巨噬細胞株(RAW 264.7)以模擬生 物體的發炎免疫反應(圖六)29。當LPS 進入體內後，體內防禦機制啟 動，將巨噬細胞及漿細胞(plasma cells)活化，此時漿細胞啟動體液 性免疫；巨噬細胞則被誘發釋出 IL-2、IL-6、IL-8、interferon-γ、TNF-α 及GM-CSF 等細胞激素而活化 iNOS，大量生成 NO 30-32。NO 又為 COX 活化因子，藉由和 COX 結構中 iron-heme