脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的抑制作用.docVIP

　　脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的抑制作用 【关键词】 中药复方脑还丹 　　摘要：【目的】探讨中药复方脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的保护作用。【方法】采用MTT法及NSE免疫组化方法观察脑还丹含药血清对经Aβ25-35处理的原代培养的新生大鼠海马神经元的影响。【结果】体外培养的新生大鼠海马神经元经Aβ25-35处理后，活细胞数减少，而脑还丹含药血清能够促进神经元的存活率以及促进神经元的生长发育，与对照组比较有显著性差异(Ｐ＜005)。【结论】脑还丹能够减轻Aβ对海马神经元的毒性作用。 　　关键词：阿尔茨海默病/中药疗法；淀粉挥β蛋白；神经元/药物作用，细胞，培养的 　　老年性痴呆，即阿尔彩默病(Alzheimer s Disease AD)，是引起痴呆最常见的进行性退行性神经病。临床表现以认知功能减退为主，病理学特征包括神经元丢失、神经元纤维缠结(NFT)、老年斑(SP)和淀粉样血管病变等。β-淀粉样蛋白(Aβ)是AD病人老年斑中的主要成分，许多研究表明Aβ与AD发病有关［１－４］。因此，保护神经元免受Aβ的神经毒性可能是防治AD的有效手段之一。笔者在具有抗老防衰作用的古方“草还丹”的基础上总结了自己长期的临床实践经验，以骨碎补、熟地、菖蒲等组方“脑还丹”，该方具有补肾填精、活血通络、涤痰开窍、平衡阴阳的功效，初步研究表明，“脑还丹”对老年性痴呆患者及痴呆动物具有一定的疗效［５－７］。我们通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、神经元特异性稀醇化酶(NSE)免疫组织化学方法以了解脑还丹对Aβ诱导神经元损害的保护作用，为脑还丹防治老年性痴呆进一步提供实验依据。 　　1材料与方法 　　11 试剂 　　DMEM/F12培养基、小牛血清均由Gibco公司提供；Aβ25～35、多聚赖氨酸、MTT均由Sigma公司提供；NSE免疫组化试剂盒、NSEⅠ抗均由博士德公司提供；二甲基甲矾(DMSO)Dhanks，胰蛋白酶，磷酸缓冲液(PBS)，40g/L多聚甲醛等。 　　12 仪器 　　倒置显微镜、超净工作台(江苏苏净BHC-1300ⅡA/B3型)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus P63450 Hanau型)；培养板(美国Orange公司)；酶联免疫分析仪(K3型)；全自动图像处理系统(德国KONTRON IBAS20型)。 　　13 动物 　　新生SD大鼠(24h内)，SD大鼠，由中山大学北校区实验动物中心提供。 　　14 脑还丹大鼠含药血清的制备 　　脑还丹由中药骨碎补15g，熟地25g，菖蒲10g等组成，使用颗粒剂(江苏江阴制药厂提供，批号0208136)，按所含生药量配制成不同浓度的药液。取健康SD大鼠30只，220～250g，雄性，随机分为3组，分别按10g#12539;kg１#12539;d－１、5g#12539;kg１#12539;d－１剂量的药液把1mL#12539;kg１#12539;d－１生理盐水连续7d，末次灌药后1h腹主动脉取血，离心制备血清，分别标记为高剂量组，低剂量组及对照组，经过滤除菌后4℃贮存备用。 　　15 淀粉样蛋白的“老化”处理 　　将Aβ 25～35 1mg溶解在1mL DMEM/F12培养基内，置于37℃恒温箱内孵育4～7d，进行老化处理，然后4℃贮存备用，用时稀释。 　　16 神经细胞培养 　　取新生SD大鼠脑，在解剖镜下分离出海马，用DHanks洗涤，125g/L胰蛋白酶消化37℃15min，过200目筛网，用含体积分数为15%小牛血清的DMEM/F12培养液终止消化并洗涤，制成单细胞悬液，计数。 　　17 MTT比色法分析 　　将细胞悬液加入到预先经过多聚赖氨酸处理的96孔板培养孔中，每孔加入05×10５个细胞(cells)，置37℃、5%(体积分数，下同)CO２培养箱内培养24h，吸出培养液，随机分成高剂量组、低剂量组和对照组，每组12孔，分别加入含体积分数为10%高剂量组、低剂量组和对照组血清的DMEM/F12培养基150μL和稀释的老化Aβ 25～35(终浓度为5μmoL/L)，置37℃、5% CO２培养箱内培养72h。终止培养前4h，每孔加入20μL MTT(5g/L)继续培养，吸出培养基，每孔加入150μL DMSO，摇晃使MTT反应的蓝色产物充分溶解，将培养板放在酶联免疫分析仪上，采用实验波长为595nm和参考波为630nm测每孔样品的光密度(Ｄ)值。各组每次8～12孔，重复3次。 　　18 NSE免疫组织化学方法分析 　　将细胞悬液(细胞密度为1×１０５/cm２，即每cm２盖玻片含1×１０５个细胞)接种于24孔板内预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4h后加入含体积分数为15%小牛血清的DMEM/F12培养液，置37℃、5% CO２培养箱