膜片钳技术在角膜研究中的应用进展.docVIP

　　膜片钳技术在角膜研究中的应用进展 【关键词】 膜片钳术 　　Abstract: The patch clamp technique and endothelium. These channels are responsible for maintaining cornea transparency. Several patch clamp modes have been used. The activities of ionic channels, the resting potential and capacity have been measured and the expression modulation of the channels has also been preliminarily studied. 　　【Keyp techniques; ion channels; cornea 　　摘要： 膜片钳技术产生于1976年，自20世纪90年代以来，这一技术被应用于角膜各层细胞的研究中. 研究结果显示，在角膜上皮细胞、内皮细胞上存在着多种离子通道，它们对于维持角膜的透明性具有重要意义. 在研究中，多种模式的膜片钳技术被应用其中. 研究者不仅记录了角膜多种细胞的离子通道活动，还对细胞的静息膜电位和膜电容进行了测量，同时对于通道的表达调控进行了初步研究. 　　【关键词】 膜片钳术；离子通道；角膜 　　0引言 　　角膜的透明性是维持视觉器官正常视功能的重要条件. 各种炎症、外伤、年龄因素以及代谢水平的变化，可以使角膜水肿、混浊，影响角膜的透明性，导致视力下降，严重者可致盲. 以前对于角膜的研究大多集中于病理学、形态学等方面. 近年来随着膜片钳技术的日臻完善，国外许多学者将这一新技术应用于角膜生理功能、病理状态的研究，以及药物疗效的评价，取得了较大的进展. 研究结果表明，在角膜的上皮细胞、基质细胞和内皮细胞中，均存在很多不同类型的离子通道，这些离子通道与细胞间的缝隙连接一同参与角膜与外部环境及房水间的离子转运，以维持角膜的透明性. 当缝隙连接与离子通道的功能发生紊乱时，则会导致角膜的透明性下降，影响视觉功能. 我们将膜片钳在角膜研究中的应用进行简要综述. 　　1概述Neher等［1］于1976年建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique）. 该技术以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动. 以后由于吉欧姆阻抗封接（gigaohm seal, 109 Ω）方法的确立和几种方法的创建，使其测量电流分辨率可达到1 pA，其电极尖端直径仅有几个微米，故对于体积较小、脆性较大的细胞亦可进行电压钳制，从而可用于多种细胞系的研究. 膜片钳的出现，为细胞电生理的研究带来了革命性的变化，此技术被认为与基因克隆并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的推动力，这一伟大的贡献使Neher和Sakmann获得了1991年度的诺贝尔生理学与医学奖. 膜片钳技术被广泛应用于细胞电生理的研究中. 自20世纪90年代以来，研究者们利用膜片钳技术从不同方面对角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜基质细胞以及角膜缘干细胞进行研究，证实了多种离子通道在这些细胞中的存在. 　　2角膜上皮细胞 　　2.1正常角膜上皮细胞的研究 　　2.1.1大电导K＋离子选择性通道1992年Rae等［2］利用膜片钳技术研究发现，在兔的角膜上皮细胞基底部存在一个大电导的K＋离子选择性通道，该通道可被细胞膜内外的奎尼丁所阻断. 而后Farrugia等［3］进一步证实这一通道是角膜上皮细胞全细胞电流的主要，通过改变细胞的渗透压可以对K＋通道进行调控：当以低渗液取代常规灌注液时，细胞水肿，可选择性激活K＋离子通道；而高渗液使细胞脱水时，则可使K＋离子通道失活；灌注液中Cl离子浓度增高时，穿孔性膜片钳可检测到类似低渗液灌注时的电流变化. 这些电流变化与细胞的静息膜电位的变化一致，说明大电导的K＋离子选择性通道在细胞渗透压改变时发生相应变化，同时影响细胞的全细胞电流和静息电位. 近年来研究者们对于K＋离子通道的调控表达进行了进一步的研究. Ta Kahira等［4］采用常规全细胞和穿孔膜片钳技术记录牛角膜上皮细胞的全细胞电流，结果证实角膜上皮细胞上存在两种不同的K＋离子通道，一种是不活泼的、电压门控性K＋离子通道，可被细胞膜的去极化完全阻断；另一种是活泼的、恒定性K＋离子通道，不能被阻断，与以上研究中的大电导K＋离子通道类似. 细胞外的脂肪酸如花生四烯酸(AA)等可抑制不活泼、电压门控性K＋离子通道，并增加活泼、恒定性K＋离子通道电流. 这一研究首次证实角膜上皮细胞中存在不活泼、电压门控性K＋离子通道，A