第23章 DNA操作的基本技术-张颖.pptVIP

* * * * * * 7版教材图21-3，485页 * 7版教材图21-11，493页 * 7版教材第21章课件 * 7版教材图21-4，486页 * 7版教材图21-5，487页 CY5蓝色、Texas Red黑色、CY3红色、6-FAM绿色 * 7版教材图21-7，489页 * 7版教材图21-9，492页 * 二、PCR技术可以进行实时、定量分析 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 7版 * 三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列 7版 * 第三节 DNA序列测定 DNA Sequencing * * DNA序列分析方法的演变和发展 20世纪70年代 双脱氧链终止法：F. Sanger 化学裂解法：A. Maxam和W. Gilbert 20世纪80年代 PCR及自动测序技术 * 一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法 （一）Sanger双脱氧链终止法利用2′，3 ′ -双脱氧核苷酸掺入中 （二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应 * 双脱氧链终止法 7版 * 7版 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 ddG ddA ddT ddC * DNA序列自动分析 ddG 红 ddT ddA 绿 ddC 蓝 橙 毛细管电泳 荧光标记 DNA合成 测序结果展示 * 二、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化 通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异 通过DNA序列测定分析人工重组的基因 通过DNA序列测定对定点突变进行确认 * 第四节 DNA芯片技术 DNA Chip Technologies * 什么是DNA芯片技术? DNA芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)； 亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 * 基因芯片工作流程 7版 * 一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析 cDNA芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段PCR产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。 寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有10~20个相对应的探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。 * 二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用 染色质免疫共沉淀-芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析； 寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 （一）ChIP-on-chip的基本原理是染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合 * ChIP-on-chip工作原理 甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联 超声波打碎 特异性抗体免疫沉淀 目的DNA片段纯化、扩增 荧光标记和芯片检测 芯片数据分析 * （二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分析 两步模型法（two-step paradigm），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。 第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处500~1 000 bp左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得粗略的目的数据集。 第二步对其进行数据挖掘和分析。 * （三）ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究 主要集中在两个领域： 第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。 第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。 表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。 ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系 * 三、芯片技术的发展——蛋白质芯片和组织芯片 蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信