第24章 11重组DNA技术-最后一节课.pptVIP

* * * * 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 将重组DNA转入受体细胞的常用方法 化学法： 氯化钙化学转化 物理法： 电击法 显微注射法 等 五、筛选与鉴定重组DNA有多种方法（筛） 遗传标志筛选法、 序列特异性筛选法、 亲和筛选法等 （一）借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选 1.抗药性标志筛选 2. 利用标志补救筛选带有载体的重组子 标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体的重组子。 3. 利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体的克隆 （1）利用抗性基因的插入失活可筛选 带有重组载体的克隆 插入失活可筛选带有重组载体的克隆 （2）利用抗性基因的插入表达也可筛选带有重组载体的克隆  例如：质粒pTR262携带来自λ噬菌体的CI基因，该基因在正常情况下表达产生阻遏蛋白，从而使tetR基因不能表达。当在CI基因中插入外源DNA后，将导致CI基因失活，从而使tetR基因去阻遏而表达。如果细菌内含有插入表达的重组体，则可在含有四环素的培养基上生长。 （3）α-互补筛选利用了β-半乳糖苷酶功能互补的基因片段 α-互补筛选（蓝-白筛选） 4. 利用噬菌体的包装特性初筛重组载体的克隆 λ噬菌体的一个重要遗传特性就是其在包装时对λ DNA大小有严格要求，只有重组λ DNA的长度达到其野生型长度的75%～105%时，方能包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清晰的噬斑，而不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。 （二）根据序列特异性可筛选出特定的重组DNA 根据序列特异性进行筛选的方法包括： 限制性内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法等 （三）亲和筛选法借助相关表达产物而 筛选阳性克隆 有时为了达到某种新的目的，需要对已克隆的DNA进行再次克隆，该过程称为亚克隆。 亚克隆的目的有多种，常见的有： ① 实现目的DNA的高效扩增 ② 表达目的DNA编码的蛋白质 ③ 对目的DNA序列进行分析 ④ 对目的DNA进行修饰（如突变、缺失、引入新的限制酶切位点等） ⑤ 获得单链DNA或RNA ⑥ 鉴定目的DNA是否具有某些特殊功能 亚克隆（subcloning）及其目的 第五节 常用的原核、真核细胞 表达体系 Frequently Used Prokaryotic andEukaryotic Expression Systems 一、原核细胞表达体系主要利用细菌表达外源蛋白 原核表达体系主要以细菌作为宿主细胞 包括大肠杆菌、 枯草杆菌、 乳酸菌、 沙门氏菌、 苏云金杆菌等 其中又以大肠杆菌表达体系应用最为广泛和最成熟。原核表达体系既可用于原核基因表达，也可用于真核基因表达。 原核表达体系既有优点也有不足 原核表达体系有以下优势： ① 宿主菌遗传背景和生理特性清楚，有多种工程菌株可供选择 ② 原核细胞繁殖能力强，操作简便、省时 ③ 大规模发酵成本低，生产潜力大 ④ 表达水平一般较真核系统高，且下游工艺简单、易于控制 原核表达系统的主要缺点： ① 原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统（如糖基化、磷酸化等），因此，针对这些需经修饰的蛋白，无法用原核表达体系获得有活性的产物 ② 目的基因不能是含有内含子的DNA ③ 细菌本身产生的内毒素等热原不易去除干净，为产品纯化增加了难度 ④ 蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性较困难，容易出现肽链的错误折叠等问题 二、真核细胞表达体系表达外源蛋白 与原核表达体系相比，真核表达体系（特别是以哺乳类细胞作为宿主细胞的表达体系）具有如下优点： ① 目的基因可以是基因组DNA或cDNA，转录后能进行加工。 ② 能对所表达的蛋白质进行加工修饰，确保二硫键的精确形成，能正确进行糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等加工 ③ 可使蛋白进行分泌表达，从而有利于蛋白的分离纯化 ④ 所表达的目的蛋白不易被降解，且对宿主细胞的影响