突变型HBV前C—C基因疫苗的构建及真核细胞表达.pdfVIP

294 · InfectDisInfo，2008，Vo1．21，No．5 · 突变型HBV前C—C基因疫苗的构建及真核细胞表达 。 张 敏 辛绍杰① 胡 燕① 侯 俊① 沈宏辉① 王志杰① 貌盼勇① 解放军军医进修学院 北京 100853 ①解放军第三O二医院 北京 100039 摘 要 目的 采用点突变技术对HBV前C—C基因中的蛋白酶切位点进行4处点突变 ，构建突变型HBV前C—CE／NH Ⅱ重组基因疫苗，转染HepG2细胞，研究其存真核细胞内的表达情况。方法 采用单引物二次PCR法对质粒 VEC依次进行 基因点突变，得到 151+154(VE2)、151+154+164+167点突变 (VE4)2种突变型疫苗，转染 HepG2细胞，通过细胞免疫化学、酶 联免疫分析、免疫印迹等方法检测其在HepG2细胞内的表达情况及表达产物的分子量。结果 VEC、VE2、VE4转染 HepG2 细胞均胞浆表达 目的蛋白，产物分子量分别为 18、2O、22kD，细胞裂解液的HBeAg含量VE4、VE2高于VEC，上清中则反之。 结论 突变型HBV前C—C基因疫苗VE2、VE4构建成功并表达预期病毒前C蛋白前体。 关键词 乙型肝炎 ；DNA疫苗；点突变；Pre—C抗原；增强子 Ⅱ 中图分类号：R5121．62 文献标志码：A 文章编号：1007—8134f2008~5—0294—04 ConstructionandexpressionofmutatedHBV precore-coreDNA vaccines ZhangMin，XinShaojie~，HuYa eta1． ThePostgraduateMedicalCollegeofPI』A．Beijing100853．China @302HospitalofPLA，Beijing100039，China Abstract Objective ToconsturctmutatedHBVpreeore—corefENHIIrecombinantDNAvaccinesbyintroducingpointmutations into4proteasecleavagesitesofHBVprecore—coregeneandtransfectthem intoHepG2celllinetoobservetheirexpressionineukaryotic cells． M ethods SinglepremiertwicePCR methodwasestablishedandpointmutationwassequentiallyintroducedintoplasmidVEC． obtainingtwomutatedvaccines，VE2f151+154mutations)andVE4f151+154+164+167mutations)，whichwerethentransfeetedinto HepG2cellsnvitro．Immunohist~hemistry．ELISAandWestblotmeasurementwereemployedtodetecttheexpressionofthetwomutated vaccinesandmolecularweightoftheirproducts．Results Targetproteinswereexpressedincytoplasm aftertransfectionofVEC，VEC2 andVEC4intoHepG2cells．withthemolecularweightofl8 20and22kD，respectively．HBeAgconcentrationwashigherincelllysate butlowerinsupernatantinVE4andVE2thanthatinVEC．Conclusions ThemutatedHBVprecore—coreDNA vaccinesVE2andVE4 aresuccessfullyconstructed，andHBVp