血清中miRNA常用提取方法的综合比较.pdfVIP

北方药学2012年第9卷第7期 31 血清中miRNA常用提取方法的综合比较 徐 翔 贺丽卉 (中国药科大学制药有限公司 南京 210009) 摘要：目的：对 目前实验室常用的4种miRNA提取方法的比较，探讨其临床实用性。方法：使用各 自的说明书进行提取miRNA，检 测 目前血液中公认含量比较高的miRNA—u6，通过RT和Q-PCR后的CT值，进行含量和稳定性比较。结果：nfiRNeasyMiniKit— TRIzol的CT值较小，稳定性也较好。结论：各种提取方法有显著差异，但是差异较小，miRNeasyMiniKitTRIzol法相对而言较好。 关键词：miRNA 提取 Q—PCR 中图分类号：R457．2 文献标识码：B 文章编号：1672-8351(2012)07-0031—02 ComparisonofcurrentlaboratoryusedofmiRNA extraction XuXiangHeLihui(ChinaPharmaceuticalUniversityPhamraceuticalCo．Ltd．，Nanjing210009，China) Abstract：Objective：ComparisonofcurrentlaboratoryusedfourkindsofmiRNA extraction，toexploreitsclinicalutility．Methods： RespectivemanualextractionofmiRNAtodetecttherelativelyhighcontentofbloodrecognizedthemiRNA—U6RTandQ—PCRCT value，contentandstability．Results：CT valueofmiRNeasyMiniKitTRIzolisthebest，mirVanaPARISkithaveagoodstability． Conclusion：Significantdifferencesinthevariousextractionmethods，butthedifferenceissmaller，andthemiRNeasyMiniKitTRlzol relativelybetter． Keyword：rIliRNA ExtractionQ—PCR MicroRNA (miRNA)是一类普遍存在于细胞中的长度为 司；TRhol购 自invitrogen公司；U6TaqManmicroRNAassay购 1825个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA在基因转录后 自ABI公司；普通PCR仪 2720、荧光定量PCR仪 7300购 自 水平上通过与靶mRNA互补结合，抑制mRNA的翻译或降解 ABI公司。 mRNA。迄今已经发现并命名的miRNA超过了9500个，在表 1．2血清采集及处理：以带分离胶的血液采集管采集血液(通过 达调控中起着至关重要的作用 ，例如发育、分化和凋亡 ，而且 检验为正常人血液)。通过离心获得无细胞血清，简言之：以 与多种癌症和疾病息息相关。 10000r／rain离心采集管 lmin，将上层血清转移至洁净Ep管，一 今年来有学者发现血液 中稳定存在疾病特异性 的 80℃冻存备用。 miRNA。后续试验中无论是芯片分析 ，还是miRNA的克隆， 2实验方法 miRNA的提取都是最基础的步骤；因此miRNA的提取至关重 2．1血清 miRNA的提取 ：以下提取血清体积都是 lO0~l，血清 要。本文旨在基于几种不同的miRNA提取方法的比较 ，为研 为同一人正常血清。按照各 自的说明书进行比例添加提取试 究miRNA的后续实验奠定基础。 剂。每种提取方法提取 5个平行样 ，获得50lxl体积RNA后保 1材料和方法 存于一80~C冰箱。 1．1试剂和仪器：mirVanaPARISkit购 自Ambion公司；miRNeasy 2．1．1mirVanaPARISkit提取miRNA：按照试剂说明中mirVana MiniKit购 自QIAGEN公司；AMV、Taq、dNTPs购 自TAKARA公 PARISProcedure中的Forliquidsampl