猪肌肉生长抑制素（MSTN）前肽定点突变载体的构建及其原核表达.pdfVIP

l…一 Onlinesystem：http：／／www．jabiotech．org 农壁生鞠技术警报 瓣揣 … r 农 业 生 物 技 术 学 报 JournalofAgriculturalBiotechn0l0gy 焉盟艘『 2012，20(4)：389396 翟 DOI：10．3969／j．issn．1674-7968．2012．04．007 研究报告 LeRer 猪肌 肉生长抑制素(MSTN)前肽定点突变载体的构建及其原核表达 姜声旺 1,2 张晓玮 2,3 王在贵 崔文涛 ’李奎 1安徽农 人学生命科学学院，合肥 230036；2中圈农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3华中农业人学动物医学院，武汉 430070 通讯作者，wzgni@sina．tom．cn；cwt1224@126．corn．ca 摘 要 肌 肉生长抑制素 (MSTN)能够 限制肌纤维的增粗增大 ，而突变的肌 肉生长抑制素前肽 fPro．MSTN—D75A)~阻‘止MSTN与相应受体的结合，从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用 。猪是我 国最 重要的肉用家畜，通过操作MSTN提高其瘦 肉产量，将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪 妊娠 3个月的胚胎为材料，提取背最长肌RNA并以此为模板，用反转录PCR扩增猪 MSTN前肽 cDNA 序列(不含信号肽 ，并将其连接到原核表达载体 pGEX．6p．1上 。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子 变为丙氨酸密码子(D75A)，构建了原核表达载体pGEX．ProM(SP．)和pGEX—ProM(SP一)D75A。重组质粒转 化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21感受态细胞并经 IPTG诱导表达，结果表明，转化pGEX．ProM(SP一)质 粒的E．coliBL21工程菌用终浓度为0．6mmo儿 的IPTG诱导5h表达情况最好；而转化pGEX．ProM (SP一)D75A的工程菌在 1mmol／L的IPTG诱导6h的条件下表达情况最好 。用 GST．Trap蛋 白纯化系统 纯化回收总分子量大小约为51kD融合蛋白 (GST蛋 白标签分子量为 26kD，MSTN前肽蛋 白分子量为 25kD)。纯化蛋 白的浓度 ProM(．SP)为 1．87mg／mL，ProM(．SP)D75A为 1．21mg／mL。本研究建立 了大肠杆 菌表达猪MSTN前肽的最佳条件，提高了生产效率，并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及 制备单克隆抗体提供基础资料。 关键词 猪，肌 肉生长抑制素，前肽 ，突变，原核表达 Plasmid Construction and Prokaryotic Expression ofa Site—directed mutantofPorcineMyostatinPropeptide-codingGene JIANG Sheng—Wang， ZHANG Xiao—W ei， WANGZai—Gui’ CUIWen—Tao LIKui 1CollegeofLifeSciences，AnhuiA．griculturalUniversity，Hefei230036，China；2InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgricultural Sciences，Beijing100193，China；3CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversiyt，Wuhan430070，China Correspondingauthor，wzgui@sina．com．cmcwt1224@126．corn．cn