水牛SUV39H1基因shRNA片段的筛选及对外源转基因表示效率的影响.docVIP

　　水牛SUV39H1基因shRNA片段的筛选及对外源转基因表示效率的影响 第一章组蛋白甲基化 1组蛋白甲基化概述 在真核细胞中，大部分的遗传信息被以一种核蛋白的形式储存在细胞核中，这种核蛋白被称之为染色质。染色质的基本单位是核小体，每个核小体由一条长147bp的DNA链缠绕着一个八聚体，这个八聚体分别由组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成，另外一种组蛋白位于核小体的表面，主要功能是将DNA固定到核小体上。染色质浓缩的结构阻碍了某些细胞程序对DNA序列的接近，如DNA复制、损伤修复和转录⑴。乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、生物素化等不同类型的化学修饰大部分都是位于组蛋白N-末端。组蛋白修饰可以通过影响DNA和组蛋白之间的亲和性，从而影响染色质的结构和基因转录表达的状态。随着更多的组蛋白修饰和组蛋白修饰复合物的发现，组蛋白修饰被称之为组蛋白密码。组蛋白甲基化是指组蛋白甲基化转移酶（His tone methyltransferase, HMTases )催化组蛋白上端的赖氨酸残基或者精氨酸残基[2]。高乙醜化代表转录启动，低乙酰化则代表转录抑制，与乙酷化不同的是，组蛋白甲基化表观修饰效应不仅受到甲基化残基位点的影响，而且还受到残基位点上多带甲基基团数目的影响,如图1所示。 2组蛋白甲基化种类 组蛋白甲基化按照所作用的氣基酸残基不同可以分为两种：赖氨酸组蛋白甲基化和精氨酸组蛋白甲基化。其中赖氨酸组蛋白甲基化作用位点包括H3K4、H3K9、H3K27、H3K36,、H3K79和H4K20，精氨酸组蛋白甲基化作用位点包括H3R2、H3R17、H3R26和H4R3。每个氨基酸残基位点都有相对应的HMTases进行催化，按照甲基化位点不同，HMTases大致可分为赖氨酸甲基化转移酶和精氨酸甲基化转移酶。赖氨酸残基被甲基化转移酶催化为单甲基化、二甲基化和三甲基化，而精氨酸残基只能被催化为单甲基化、对称二甲基化和不对称二甲基化。研究证明，组蛋白甲基化是一类相当复杂的表观修饰，不仅不同残基的甲基化代表着不同表观修饰效应，而且在同一残基上不同数量的甲基化基团也可能存在相当大差别的表观修饰效应。以下对几种比较重要的甲基化位点进行阐述。 第二章SUV39H1基因研究进展 1研究历史 SUV39H1属于KMT1家族，KMT1家族包括在裂殖酵母和植物中发现的Clr4，在果妮中发现的Su (var)3-9和G9a。哺乳动物中至少含有四种转移酶：SUV39H1/2. G9a、GLP和SETDB1。SUV39H1是Louise在1999年在人中发现第一种哺乳动物组蛋白赖氨酸甲基化转移酵，并将其命名为SUV39Hr。其在细胞分裂间期主要分布在异染色质位点，而在细胞分裂中期主要聚集于着丝粒特殊位点[35]。SUV39H1结构在各个物种中相对比较保守，暗示了哺乳动物中的SUV39H1可能与果姆中的Su (var) 3-9和裂殖酵母中的Clr4具有类似的功能，能够影响基因的表达和异染色质的形成。在人的T-细胞中，SUV39H1可以通过TGF-p-Smad途径募集到IL-2的启动子处，催化其启动子处的H3K9为H3K9me3，抑制IL-2的转录表达[38]。Meng的研究发现，H3K9甲基化相对于H3K9乙酰化占有更主动地位，P16和MLH1是抑癌基因，在人胃癌细胞中处于沉默状态，沉默位点主要与H3K9处的低乙酰化和高甲基化有关。当用TSA处理后，目的基因处H3K9的乙酷化明显降低，但目的基因的沉默状态基本没有变化；用DNA甲基化抑制剂(5-Aza-Dc)处理后，目的基因的转录才得以恢复[39]。目前为止，已经成功克隆出人，黑獲獲，牛，绵羊，狗，小鼠及斑马鱼的SUV39H1序列，并对SUV39H1的功能结构，作用机理有了越来越深入的了解。 2SUV39H1基因的结构与分布 SUV39H1蛋白主要由两部分组成，分别是C端的SET结构域和N端的染色质域。SET结构域具体可分为SET前区、SET和SET后区，是酶促反应中SUV39H1催化活性的关键区域。染色质域是一段由50个氨基酸组成的保守序列，广泛地识别染色质中的一些特殊位点，包括甲基化的赖氨酸组蛋白、DNA和RNA结合位点[41]。染色质域在各种转移酶中的相似度都比较高，以人和小鼠为例，两者整个序列相似度为30%，染色质域的相似度为40%。SUV39H1的染色质域对于SUV39H1的催化活性相当重要，在SUV39H1染色质域突变或者敲除，SET结构域完好保存的情况下，SUV39H1的催化活性将会受到损坏。所以推测在SUV39H1的催化区域结合到勒甲基化蛋白的过程中，SUV39H1的染色质域发挥了重要的作用[42]。在哺乳动物中，除了人的SUV39H1的C端含有更长的螺旋结构，其他物种的都大致相同。在酶的催化水平上，SUV