硫酸盐还原菌类群分离培养及PCR研究鉴定.docVIP

硫酸盐还原菌类群分离培养及PCR研究鉴定摘要： ［目的］ 探讨分离培养和聚合酶链反应（PCR）在硫酸盐还原菌类群分析鉴定中的应用。 ［方法］ 采用分离培养和PCR对贵州阿哈湖沉积物中硫酸盐还原菌类群进行分析，并对分离纯化的一株硫酸盐还原菌进行鉴定。 ［结果］ 贵州阿哈湖沉积物硫酸盐还原菌类群为脱硫肠菌属、脱硫叶菌属和脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属；纯化菌株经PCR扩增初步鉴定为脱硫叶菌属，菌株形态与鉴定结果相符。 ［结论］ 采用分离培养结合PCR，可以对硫酸盐还原菌类群进行分析和鉴定。 关键词：分离培养；聚合酶链反应；硫酸盐还原菌 文章编号:1006-3617(2007)01-0040-03 中图分类号:R117 文献标识码:A 硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）是一类严格厌氧菌，其在代谢活动中可以利用硫酸盐作为电子受体并产生高浓度 H2S。研究环境中硫酸盐还原菌类群和分子生物学特征变化，对认识全球和局部区域环境的硫循环规律、生态系统对酸雨的响应机制以及重金属等环境污染物迁移转化有着重要的理论意义和实际应用价［1～3］。 硫酸盐还原菌类群分析鉴定方法主要有传统学分类［4，5］和分子生物学分类［6～8］，各有不同的优缺点。我们利用分离培养和PCR扩增对贵州阿哈湖沉积物进行了硫酸盐还原菌类群分析，并将一株纯化的硫酸盐还原菌初步鉴定为脱硫叶菌属，菌株形态学特征也符合该类群。本文目的在于优化硫酸盐还原菌分离培养条件，探讨分离培养和PCR扩增对硫酸盐还原菌类群分析和鉴定的可行性。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 硫酸盐还原菌培养基 乳酸2.5 ml，Na2SO4 1.0 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，酵母膏1.0 g，L-半胱氨酸0.6 g，0.1%刃天青1 ml，FeSO4 2.5 g；硫酸盐还原菌固体培养基加入2%琼脂。 1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker和引物均为华美公司产品提供或合成，电泳用琼脂糖购于Shanghai Yito公司。 1.1.3 仪器 超净工作台（苏州安泰公司，SW-CJ-1F型）；PCR梯度扩增仪（美国Bio-Rad公司）；DNA定量仪（美国Beckman公司，640型）；凝胶成像及分析系统（美国Bio-Rad公司，75S02580型）；Bbo3-A厌氧菌培养罐（北京百信生物技术有限公司）；氮气手套箱（美国Fisher公司）；沉积物-水界面采样装置为本研究所参考他人研究结果［9］自制。 1.2 方法 1.2.1 样品采集 利用湖泊沉积物-水界面采样装置，采取贵州阿哈湖湖水深21 cm处沉积物。立即于氮气手套箱中，按1 cm距离将柱芯沉积物分样，分样后迅速将样品带至实验室处理。取沉积物柱芯7 cm处样品，进行硫酸盐还原菌分离纯化培养。 1.2.2 硫酸盐还原菌分离纯化培养 接种适量沉积物于硫酸盐还原菌液体培养基中，32 ℃厌氧条件富集培养5 d；取富集液接种于硫酸盐还原菌固体培养基，32 ℃厌氧条件分离培养3 d；接种优势的黑色菌落于固体培养基，32 ℃厌氧条件纯化培养3 d；接种纯化细菌菌落于液体培养基中，32 ℃厌氧条件液体增菌培养3 d。 1.2.3 菌体染色及形态特征观察 参见文献［10］对纯化菌株分别进行革兰染色、鞭毛染色和芽孢染色。 1.2.4 DNA提取 采用酚-氯仿法对分离培养、纯化培养菌落和液体增菌液，分别进行细菌DNA提取。 1.2.5 PCR扩增 应用依据硫酸盐还原菌6个类群16SrDNA保守区设计的6对特异性引物［8］（表1），分别进行硫酸盐还原菌6个类群的PCR扩增。PCR扩增均为30个循环，退火温度为52～58 ℃。每个反应体系中含10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，2 U Taq DNA聚合酶，0.4 μmol/L上下游引物，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μg DNA模板。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。每次PCR均设待扩增类群纯培养为阳性对照，大肠埃希菌（ATCC 8099）为阴性对照。 2 结果 2.1 分离、纯化培养和纯化菌株形态特征观察 样品富集后进行固体培养基分离培养，3 d后培养基上出现大小不等的黑色菌落，即为不同类群硫酸盐还原菌菌落。对硫酸盐还原菌优势菌进行纯化培养后，得到中等大小、黑色、光滑的椭圆形菌落（图 1）；纯化菌株镜下形态为G+球菌，菌体呈卵圆形，多成对分布，单鞭毛，无芽孢，形