新生大鼠HIBD后海马增殖细胞分化和bFGF的相关性探讨.doc

　　新生大鼠HIBD后海马增殖细胞分化和bFGF的相关性探讨 ：张敏，蒋犁，胡燕，乔立兴，黄莉 【摘要】 目的： 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后海马齿状回增殖细胞分化情况,及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 干预对其的影响，探讨实验大鼠的远期行为学变化。方法： 7日龄SD大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组，建立HIBD模型（假手术组不予缺氧处理），分别于术后5、10、14、21 d取脑，采用免疫荧光双标记观察大鼠海马齿状回BrdU/MAP2、BrdU/GFAP阳性细胞表达，并应用Y迷宫法进行行为学测定。结果： 缺氧缺血组及bFGF干预组BrdU/MAP2、BrdU/GFAP阳性细胞于术后10、14 d较5 d时有所升高（P＜0.05），21 d下降至5 d时的水平。与假手术组及缺氧缺血组比较，bFGF干预组于HIBD后各个时间点BrdU/MAP2、BrdU/GFAP阳性细胞均有所增加（P＜0.05）。Y迷宫测试显示bFGF干预组学习记忆能力较缺氧缺血组有所提高（P＜0.05）。结论： HIBD后海马齿状回增殖细胞存在分化为神经元及星形胶质细胞的现象，bFGF能够促进HIBD后海马齿状回增殖细胞向神经元及星形胶质细胞分化，并可以改善大鼠后期行为记忆能力。 【关键词】 缺氧缺血性脑损伤； 海马； 齿状回； 细胞分化； 碱性成纤维细胞生长因子； 大鼠 目前研究证实，成年哺乳动物脑内的侧脑室脑室下区(subventricular zone,SVZ)和海马结构的颗粒下区(subgranular zone,SGZ)存在神经干细胞(neural stem cells,NSCs)［1］，可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞［23］。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast groic brain damage，HIBD）后海马齿状回(dentate gyrus,DG)存在神经发生现象，且外源性bFGF干预能够促进神经发生［4］。本实验进一步观察新生大鼠脑HIBD后海马DG增殖细胞向神经元和星形胶质细胞分化的情况及外源性bFGF的影响，并应用Y电迷宫检测各组实验大鼠远期学习记忆能力，从而探讨新生儿HIBD后脑组织的内源性修复机制及bFGF可能的保护作用，为临床 治疗 新生儿HIBD提供相关的试验依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 出生7 d的SD大鼠90只，雌雄不限，体重12～14 g,由复旦大学提供鼠种，东南大学医学院实验动物中心繁殖。 1.2 药物及试剂 鼠抗尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）单克隆抗体、兔抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、兔抗人微管相关蛋白2（MAP2）、罗丹明标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG、bFGF试剂、胃酶、正常山羊血清均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，OCT为美国进口产品，其余试剂为分析纯。 1.3 模型制备 按照Rice等［5］的方法制备HIBD模型，分为假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组。假手术组仅游离左侧颈总动脉但不结扎，不进行缺氧处理；缺氧缺血组和bFGF干预组进行缺氧缺血处理。所有新生鼠均由母鼠代养。 1.4 动物分组与处理 114只大鼠中，用于免疫荧光检测96只，即假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组各32只；用于行为学测定18只，即假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组各6只。用于免疫荧光检测的各组大鼠于损伤后48 h开始腹腔注射BrdU，剂量100 mg·kg-1，2次·周-1，设损伤后5、10、14、21 d（n=6）时间点，假手术组时间点与缺氧缺血组一致。bFGF干预组于HIBD后即刻及之后每天的同一时刻，腹腔注射bFGF试剂，10 μg·kg-1，连续7 d。用于行为学检测的动物不给予BrdU注射，应用Y电迷宫对各组60日龄大鼠测试学习记忆能力，并于24 h后(61日龄)复测，检测各实验大鼠24 h记忆保持能力。 1.5 HE染色及免疫荧光双标检测 各组于损伤及干预后5、10、14、21 d，戊巴比妥钠10 mg·kg-1腹腔注射深麻，开胸，心脏灌注4％多聚甲醛固定，取出脑组织，4％多聚甲醛后固定24 h，30％蔗糖溶液沉底。取丘脑中1/3平面（按照大鼠脑组织学图谱，选择前囟1.7～0.3 mm为切面）行冠状位冰冻切片，片厚10 μm，每隔4片取1片，分别作HE染色和免疫荧光双标染色。 1.5.1 HE染色 各组部分切片行苏木素、伊红染色，中性树胶封片。在光学显微镜（日本OLYMPUS）下对各组各时间点大鼠海马区进行形态学观察，以确定各选择区免疫荧光阳性细胞的定位。 1.5.2 免疫荧光双标染色 各组部分切片回温干燥30 min，移至湿盒中，70%酒精固定10 mi