新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定.doc

　　新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定 【关键词】 大鼠 肌源性干细胞 体外培养 Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods By tethod, the rat muscle e . The proliferation ability of muscle-derived stem cells munofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs in(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells. Key uscle derived stem cells ; culture in vitro 近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。 1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照 参考 文献 所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。 1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。 2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。 2 结 果 2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成 规律 性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时