黑素细胞体外培养探究进展及意义.docVIP

黑素细胞体外培养探究进展及意义黑素细胞(Melanocyte 简称MC)来源于外胚层的神经嵴,在胚胎8～10周时逐渐迁移至皮肤,广泛存在于机体各组织,可见于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周围、外周神经及交感神经干、软脑膜、内耳、胆囊、卵巢等结构。通过黑素细胞(MC)的体外纯培养可以研究黄褐斑、白癜风、白发等色素障碍性疾病的发病机制,也可以利用黑素细胞模型来筛选治疗这些疾病的药物和方法。同时对于研究皮肤色素代谢、皮肤老化、良恶性黑素肿瘤也具有重要意义[1]。近十年来,黑素细胞的体外培养方法逐渐成熟,从需要人工配制和添加各种培养成分到商品化培养基的出现,从需要添加致癌和毒性培养成分到新的无毒性、无致畸变培养基的出现,从培养表皮来源的黑素细胞到培养毛囊、葡萄膜等各种来源的黑素细胞甚至黑素细胞的干细胞,从单一黑素细胞的培养到含黑素细胞等多种细胞混合的组织工程皮肤培养,培养条件的成熟为我们利用这些模型进行相关研究创造了便利。现将黑素细胞的体外培养研究进展及研究意义综述如下: 1黑素细胞的培养来源 黑素细胞(Melanocyte,MC)来源于外胚层的神经嵴,在胚胎8～10周时逐渐迁移至皮肤。黑素细胞广泛存在于机体组织,最常见于表皮、毛囊、真皮、眼、血管周围、外周神经及交感神经干、软脑膜、内耳、胆囊、卵巢等,分为树突型和非树突型黑素细胞,主要分布在表皮基底层,约占基底层细胞的10%,可将黑素颗粒转移至角质形成细胞。表皮MC基底以半桥粒与基底膜相连,但不与周围角质形成细胞形成桥粒。MC在顶部发出数个突起,每个突起与10～36个角质形成细胞接触,形成表皮黑素单元。黑素细胞的主要功能是在黑素小体合成黑素颗粒,黑素颗粒进入角质形成细胞后像伞样或者帽样覆盖于细胞核顶上方,保护细胞核免受紫外线辐射损伤[2]。而非树突型黑素细胞主要分布于色素膜、视网膜、脑膜,不能转移黑素颗粒。黑素细胞形状各异,大小不一,可呈圆形、椭圆形、梭形等,胞质透明,胞核较小。人的表皮约有20亿个黑素细胞,重约1g,平均每平方毫米1 560个对称分布于全身。虽然人种之间黑素细胞数量较恒定,无明显差异。但每个体各部位间黑素细胞的数量却不尽相同。在躯干部密度最小,约为900个/平方毫米,阴茎包皮最多,约有2 400个/平方毫米,头皮约有2 000个/平方毫米,其他部位约为1 000个/平方毫米[2]。此外,在暴露部位、身体褶皱处及乳晕、腋窝、生殖器及会阴部,黑素细胞的分布密度亦较高。因此,目前黑素细胞培养常用的供区为包皮,也有学者成功进行了毛囊黑素和脉络膜黑素细胞的培养[3-4]。 2黑素细胞的培养条件 MC在普通培养基中很难生长,这是因为正常皮肤中MC数量很少,约占表皮细胞的2%～4%,占基底层细胞的8%～10%,同时,其增殖能力较角质形成细胞和成纤维细胞弱,体外培养的早期常因角质形成细胞或成纤维细胞的过度生长而失败。黑素细胞培养条件进展如下: 2.1 建立含有十四烷酞佛波醇乙酯(TPA)+霍乱毒素(CT)的黑素细胞培养方法:1982年,Eisinger[5]首次体外培养皮肤MC成功。他们利用胰蛋白酶消化全厚皮标本分离出表皮,用胰蛋白酶消化成单细胞悬液。但是需要在培养基中添加l0ng/ml的TPA和l0nM的CT,并认为体外培养成功的关键是TPA对KC的毒性作用和CT对Fb的抑制作用。他们还发现TPA的作用具有浓度依赖性,TPA在浓度为1～10ng/ml时可抑制KC的贴壁与生长,但却刺激MC的贴壁和增殖,而0.1ng/ml和100ng/ml的TPA不具有这种作用。10ng/ml的TPA和10nM的CT, pH7.2和5%的小牛血清是MC的最佳培养条件。至今这一方法仍被很多学者采用。 2.2 不含TPA但需要CT的培养方法:由于TPA是公认的强致癌剂,在体内不易被代谢,可长期对细胞产生多种生物学效应,因此,有人担心利用TPA培养出的黑素细胞用于临床移植时可能存在一定的致癌风险。1988年,Halaban等[6]首先发现bFGF可刺激MC的生长。他们将处于对数生长期的KC和Fb的提取液与MC共同培养,用[3H]胸苷掺入法检测MC的DNA合成状况,发现提取液可显著增加MC的DNA合成,提示bFGF是MC的天然分裂原。国内学者丁国斌[7]利用碱性成纤维细胞生长因子/霍乱毒素建立了人正常黑素细胞体外纯培养系统。也有学者利用5-Fu[8]、下丘脑提取液(bovine hypothalamus extract BHE)或者内皮素(ET)代替TPA来进行黑素细胞的培养[9],其共同特点是这些物质具有细胞的有丝分裂原活性。以上这些培养方法大都采用DMEM、RPMI 1640培养基或者MCDB153作为基础培养基。 2.3 不含CT但需要TPA的培养方法:由于担