卡巴胆碱对脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放炎症细胞因子影响及其受体的研究.pdfVIP

军目．苴修掌院硕士掌位论文 卡巴胆碱对脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞 释放炎症细胞因子的影响及其受体研究 中文摘要 目的：1．观察卡巴胆碱时脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放炎症细胞因 子的影响；2．研究卡巴胆碱抑制脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放促炎细胞 因子的受体途径，为卡巴胆碱用于脓毒症和多器官功能障碍等过度炎症性痰 病的防治提供实验依据． 方法：采用脂多糖(LPS，100ng／mL)刺激大鼠腹腔巨噬细胞模型，用酶联 免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光法进行研究．研究分二部分进行：1．卡已胆 碱对LPS刺激巨噬细胞释放炎症细胞因子的影响以及和其他胆碱能受体激动 刺作用的比较取雄性Wistar大鼠腹腔巨噬细胞，调整浓度为lO‘细胞／mL， 0．2mmol／L、 2mmol／L．K2 加入24孔细胞培养板中．分别加入卡巴胆碱(K1 K3 0．2 6种浓度)． 0．02mmol／L，K42¨mot／L．K5gtmot／L，K60．02¨mot／L N样胆碱能受体激动剂烟碱(nicotine)或M样胆碱能受体激动剂毒草碱 胞培养箱中孵育4h．检测细胞培养上清液中促炎细胞因子TNF一0【，IL一6和 抑炎细胞因子IL-10的浓度．实验分为5组：①空白对照组C；②LPS对照组， L；⑦卡巴胆碱组，x；④烟碱组，N；⑤毒草碱组，M．其中K组用6种不同 浓度卡巴胆碱(K1-K6)观察其作用的差异并确定后续实验中胆碱能受体激动 荆的浓度．2．卡巴胆碱抑制LPS刺激巨噬细胞释放促炎细胞因子的受体途径 取上述浓度巨噬细胞置于24孔细胞培养扳中，加入M样胆碱能受体拮抗剂阿 托品或N样胆碱能受体Ot7亚基(Ot7nAChR)特异性拮抗剂仅—银环蛇毒素(Ct -Bgt)，室温下孵育15min；后续实验步骤同第一部分．检测细胞培养上清液 中TNF-a和IL-6的浓度．实验分为6组：①卡巴胆碱组，譬：②烟碱组，N； ③阿托品+卡巴胆碱组，AK；④阿托品+烟碱组，AN；@银环蛇毒素+卡巴胆碱 组，BK；⑥银环蛇毒素+烟碱组，BN．免疫荧光法实验取上述浓度细胞，在6 孔培养板中制作细胞爬片．先用卡巴胆碱或烟碱(5mmol／L)处理lSmin，再 pg／mL)，4℃孵育15min． 加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的a—Bgt(30 2 军曩净朝眵掌院习|．b掌位说．二≮ 冲洗、封片后，在荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光强度并摄 片．实验分为4组：①阴性对照组；②阳性对照组：单纯用FITC-a-Bgt标 记细胞；⑦烟碱对照组：烟碱+FITC—a-Bgt；④卡巴胆碱组：卡巴胆／成+FITC— a—Bgt。 结果： 1．正常大鼠腹腔巨噬细胞在体外RPMll640培养基中表达少量的 较空白对照组均显著增加．2．用K1-K66种浓度的卡巴胆碱处理巨噬细胞后， 各浓度组TNF—ot水平均低于L组．其中，K1．K2，x3组与L组有显著差异． 选择K3为后续实验的胆碱能受体激动剂浓度．3．与L组相比，K组TNF-。【和 IL-6水平均显著低于L组；与M组相比，K组和N组降低地更明显；K组和N 组之间无显著差异．与L组相比，K组和N组IL-10水平元显著变化．5．与 和IL-6水平无显著变化；与K组相比，醒组TNF-a和IL-6水平显著升高； 同样，与N组相比，BN组TNF-仅和IL-6水平显著升高．6．免疫荧光法实验 结果．FITC一仅-Bgt标记后，细胞膜位置可见明显的荧光；而用高浓度的烟 碱和卡巴胆碱处理后再用FITC-ot-Bgt进行标记，细胞表面的荧光强度明显 降低． 结论： 1，卡巴胆碱能显著抑制LPS刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放TNF_a 和IL-6，并呈剂量依赖性，但对IL-10水平无显著影响；2，卡巴胆碱的抗 炎作用与烟碱类似，两者均显著强于毒簟碱；3、ot-Bgt能显著降低卡巴胆 碱争烟碱与巨噬