人Bmi-1基因shRNA慢病毒表达载体的构建、病毒的浓缩和其病毒滴度的测定.pdfVIP

目 录 1、论文：人Bmi-1 基因 shRNA 慢病毒表达载体的构建、病毒的浓 缩及其病毒滴度的测定 中英缩略词对照表„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„12 讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„21 2、综述：„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 3、致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 4、作者简介„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„34 基金课题编号：遵义市汇川区课题 中英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 NPC nasopharyngeal carcinoma 鼻咽癌 shRNA short hairpin RNA 短发卡状RNA b-cell-specific-moloney-murine B 细胞特异性莫洛尼白 Bmi-1 leukemia virus insertion site 1 血病毒插入位点1 PCG polycomb group 多梳基因家族 EMT epithelialmesenchymal transition 上皮间质转化 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 rpm Revolutions per minute 每分钟转速 1 人Bmi-1 基因shRNA 慢病毒表达载体的构建、病毒的浓缩及其 病毒滴度的测定 中文摘要 目的：构建人Bmi-1 基因的慢病毒载体，通过转染293T 细胞收集病毒液，浓缩病毒 液并对该病毒液进行滴度的测定。 方法：设计以Bmi-1 基因为靶点的短发夹状RNA （shRNA ），将3 条Bmi-1 基因的 shRNA 片段插入至慢病毒载体，对其进行筛选及鉴定。转染具有高转移性的293T 细 胞，收集病毒液并对病毒液进行浓缩，利用荧光滴度法检测病毒的滴度。 结果：构建含有 Bmi-1-shRNA 的重组慢病毒载体，经转化大肠杆菌DH5 α后提取质 粒，与空载体均经EcoRI 和BamHI 双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定。测序结果证实重 组的RNA 干扰慢病毒载体均有一段与实验设计合成的靶向链相符。测序结果显示重组 构建成功。将筛选出的重组慢病毒载体 PLVX-shRNA -Bmi-1 与包装质粒 PLP1、PLP2 2 和PLP/VSVG 共转染293T 细胞，同时设立空载体为对照组。收集的病毒浓缩液经稀释 后感染293T 细胞，利用荧光滴度法成功检测出病毒滴度。 结论：成功构建了Bmi-1 基因的shRNA 慢病毒表达载体，通过转染293T 细胞后获得 了该基因的病毒液并对病毒液进行浓缩，包装成慢病毒颗粒，通过感染目的细胞后用 荧光法成功测定出该病毒液的滴度，为探讨下一步Bmi-1 基因对鼻咽癌细胞的功能影 响奠定了基础。 关键词：Bmi-1；shRNA 干扰；转染；