卵巢切除小鼠骨组织中肿瘤坏死因子α基因表达及细胞定位.docVIP

卵巢切除小鼠骨组织中肿瘤坏死因子α基因表达及细胞定位 　【摘要】 目的 观察卵巢切除小鼠骨组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）的基因表达及细胞定位。方法 小鼠双侧卵巢切除12 w后，通过原位杂交观察骨组织中TNFαmRNA的表达及细胞定位，测定骨组织阳性细胞染色积分光密度值。结果 卵巢切除小鼠骨组织中TNFαmRNA表达明显强于对照组（P＜0.01）。成骨细胞、骨髓基质细胞和骨小梁周边骨细胞具有较强的TNFαmRNA杂交信号。结论 卵巢切除导致骨组织成骨细胞系TNFαmRNA的表达升高，TNFα在卵巢切除小鼠骨丢失中可能起重要作用。 【关键词】 肿瘤坏死因子α；卵巢切除；原位杂交；骨质疏松 妇女绝经后骨质疏松是由于雌激素水平降低，引起骨代谢发生一系列变化，致使骨吸收大于骨形成所致。近年来体外实验及临床研究证实肿瘤坏死因子α（TNFα）是重要的骨吸收因子之一，与成骨细胞和破骨细胞的增殖分化密切相关〔1,2〕。但在骨质疏松骨微环境中TNFα基因表达变化目前研究很少。本实验制备卵巢切除小鼠骨质疏松模型，通过原位杂交技术，直接检测骨组织中TNFαmRNA的表达并进行细胞定位，以进一步探讨TNFα在卵巢切除小鼠骨丢失中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物与分组 24只4月龄Balb/c小鼠，动物质量合格证号：SCXK(辽)20030016，体重18～21 g,沈阳医学院实验动物中心提供。随机分成模型组和假手术组。每组各12只，实验动物均在25±2℃，通风良好条件下分笼饲养，自由摄食，饮水。 　　1.2 造模与取材 实验小鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（20 mg/kg），下腹部剪毛消毒后，剪开约1 cm 的正中切口，模型组行双侧卵巢结扎切除术，逐层缝合，术后肌注青霉素预防感染。假手术组除未行卵巢结扎切除外，其余步骤同模型组。术后12 w测量每只小鼠全身骨密度（BMD）,确立骨质疏松动物模型。处死动物后，立即按原位杂交要求，无RNA酶操作取左侧股骨上端，放入经DEPC水处理的4%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h，取出后置入10% EDTA溶液中，用微波脱钙法脱钙累计4 h，系列酒精脱水，石蜡包埋，连续纵行组织切片，厚4 μm。 　　1.3 检测指标和方法 BMD运用DPXL型Lunar双能X线BMD检测仪，通过计算机系统软件测量每只小鼠全身BMD；骨组织TNFαmRNA运用原位杂交测定：随机引物法标记探针，采用地高辛标记的TNFα cDNA探针作为检测其mRNA的探针，按照原位杂交检测试剂盒说明进行操作，原位杂交探针及试剂盒均购自武汉博士德生物公司。定量结果经电脑图像分析获得，测定骨组织和骨髓阳性细胞染色积分光密度值。每个标本随机取3个视野，取其平均值作为该标本阳性细胞染色积分光密度值。 　　1.4 统计学处理 数据用SPSS11.5软件处理。数据以x±s表示，组间比较采用t检验，并将检测指标进行相关分析。 　　2 结果 　　2.1 BMD 检测结果 术后12 w，模型组BMD为（0.084±0.006）g/cm2,假手术组为（0.098±0.006）g/cm2。两组差异显著（P＜0.01），说明去卵巢12 w后，骨质疏松病理模型复制成功。 　　2.2 原位杂交检测观察 模型组和假手术组均有TNFα mRNA的阳性表达，模型组阳性细胞表达明显强于假手术组，主要位于骨小梁周边骨细胞，成骨细胞和骨髓基质细胞中。见图1。 　　图1 两组骨组织TNFα mRNA原位杂交 （40×）（略） 　　2.3 TNFαmRNA阳性细胞染色积分光密度值 模型组为165.82±0.54，假手术组为141.13±0.82，表明模型组骨组织TNFαmRNA基因表达含量明显强于假手术组（P＜0.01）。 　　2.4 TNFαmRNA表达水平与BMD相关分析结果 模型组骨组织中TNFαmRNA与BMD呈负相关（r=0.771,P＜0.05）,而假手术组骨组织中TNFαmRNA与BMD无明显的相关性。 　　　3 讨论 　　临床观察发现〔1〕，切除卵巢的患者体内TNFα水平升高，接受雌激素治疗的患者TNFα恢复到正常水平，说明随着雌激素水平的下降，TNFα的分泌增多，雌激素对TNFα的分泌具有调控作用。Ralston等人在培养成骨细胞时发现，卵巢切除组TNFα的产生增多，加用雌激素补充治疗组TNFα恢复到正常水平〔2〕。体外培养骨组织时加入TNFα可以明显促进破骨细胞骨吸收，表现为促进破骨细胞前体分化成熟，增强破骨细胞活性〔3〕。但在体内，雌激素缺乏导致骨组织TNFα mRNA表达变化及骨组织中哪些细胞表达TNFα研究很少。 卵巢切除致雌激素缺乏引起的骨丢失与绝经引起的骨量下降，具有许多