耶氏酵母POX5基因改造及其对γ-癸内酯产量影响.pdfVIP

摘 要 全的天然食品香料需求日益增加，本文尝试通过基因敲除的手段敲除耶罗维亚酵母 (Yarrowia 支路，获得POX5单倍体缺陷菌株，为工业生产中提高丫-癸内酯产量和进行多基因缺 失菌种改造奠定基础。 增引物以及4对验证引物。其中合成敲除组件的扩增引物游5’末端由60个与POX5 基因上下游同源的核苷酸序列组成；3’末端由20个和pUG6质粒上的loxP位点同源 基因敲除序列组件。敲除组件转化到耶氏酵母中后与POX5基因序列上下游同源的60 化子G418抗性。多种PCR方法反复验证为正确的阳性克隆子后，进一步转化携带可 重组酶，此酶的表达可以切除两个loxP位点间的kanMX标记基因，导致成功切除 KanMX的菌株会失去G418抗性。 PCR检验中不仅发现了POX5单倍体缺陷型菌株，而且发现了有部分耶氏酵母菌 突变为二倍体，将突变菌在适宜的McClary产孢培养基上诱导二倍体产孢，用2％的 蜗牛酶将子囊壁破裂，释放孢子，筛选成功缺失POX5基因的单倍体耶氏酵母菌。成 功菌传代培养，诱导质粒pSH65丢失，最终得到POX5单倍体缺陷型菌株。 成功菌株经发酵培养后，气相色谱法测定发酵液中GDL含量。与原始耶氏酵母 菌比较，耶罗维亚酵母POX5单倍体缺陷型菌株本身并没有提高t癸内酯产量，但是 可以作为下一步与其他基因进行组合缺失的出发菌。 关键词：丫一癸内酯；Cre／loxP；POX5单倍体；耶罗维亚酵母 一 争0 I、． ABSTRACT akindofnaturalfoodflavor．Theannualmarketfor The?-decalactone(GDL)is hasbeen inrecent ordertoconstructa Yarrowia 7-decalactonegrown years．In GDL-yield tO thePOX5toblockthecatabolismofGDLin attempteddisrupt lipolytica(YL)，we gene Yarrowia mutantYL-POX5was for haploid increasing lipolytica．The gained．It’Spossible in GDLin and knockoutinYarrowia future． industryproductionmulti-gene lipolytica Inthis andKanMXresistancemarkerwereusedtoconstruct paper,Cre／loxPsystem