银屑病患者角质的形成细胞对T淋巴细胞CD25、CD69表达影响实验研究.docxVIP

材料和方法一、标本来源经临床或病理确诊的寻常型进行期银屑病患者１０例，男６例，女４例，年龄１１－４６岁，平均２６．８岁，病程ｌＯ日．２０年，均为２００６年７月－２００７年２月太原市中心医院门诊或住院病人，就诊前一个月内全身未使用皮质类固醇激素、免疫抑制剂及维胺酯类药物。均征得患者同意，采集外周血５ｍＬ，取皮损及皮损周围未受累皮肤：１０例正常人血液采自门诊正常体检者。正常对照与患者性别、年龄相匹配。二、试剂及材料１、分离培养试剂、材料Ｄｉｓｐａｓｅ裂解酶购自Ｒｏｃｈｅ公司，胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ）购自上海生工生物工程技术有限公司。ＲＰＭＩｌ６４０培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司，胎牛血清（ＦＩＳ）购自杭州四季青公司，淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司，尼龙棉（３Ｄ尼龙一６短纤维）购自上海化纤九厂，２４孔培养板购自Ｃｏｍｉｎｇｃｏｓｔａｌ＂公司。２、流式试剂ＦＩＴＣ（异硫氰酸荧光素）标记的ＣＤ２５、ＰＥ（藻红蛋白）标记的ＣＤ６９鼠抗人单抗及相应的ＩｇＧ同型对照购自美国ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司。三、分组设计将研究对象分为以下各组：银屑病皮损角质形成细胞＋自体外周血Ｔ细胞共培养组银屑病非皮损角质形成细胞＋自体外周血Ｔ细胞共培养组银屑病自体外周血Ｔ细胞自然增殖组银屑病皮损角质形成细胞＋正常人外周血Ｔ细胞共培养组银屑病非皮损角质形成细胞＋正常人外周血Ｔ细胞共培养组正常入外周血Ｔ细胞自然增殖组培养７２ｈ后采用流式细胞术检测各组Ｔ细胞表面活化标志ＣＤ２５、ＣＤ６９的表达。四、实验方法１、角质形成细胞的分离及细胞悬液的制备（１）皮肤组织常规处理：生理盐水清洗标本后置于青、链霉素双抗液（青霉素１００Ｕ／ｍＬ、链霉素１００ｕｇ／ｍＬ）中浸泡３０ｍｉｎ。生理盐水反复冲洗，尽量除去皮下组织。（２）将皮肤组织剪成Ｏ．５ｃｍ×ｌｃｍ大小的皮块，上皮面朝上置于含０．２５％Ｄｉｓｐａｓｅ裂解酶铺有两层纱布的培养皿中，４℃过夜（１６ｈ）。（３）无菌镊轻轻分离真、表皮，将表皮置于青霉素小瓶，剪刀剪碎，加入Ｏ．２５％胰２山西医科大学硬士学位论文蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ），于３７＂Ｃ、５％Ｃ０２培养箱消化１０ｒａｉｎ后，加等量完全培养基终止消化，用吸管反复吹打，滤网过滤除去残渣，以１０００ｒｐｍ离心１０ｒａｉｎ去上清。（４）用含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭｌｌ６４０培养基调整细胞浓度至５Ｘ１０５／ｍＬ。将单细胞悬液以１×１０５，孔接种于２４孑Ｌ培养板，３７℃、５％Ｃ０２、饱和湿度培养箱中孵育（见图ｌ、２）。２、外周血Ｔ淋巴细胞的分离及培养（１）外周血单个核细胞的分离：①采集银屑病患者及正常人外周血５ｍＬ于肝素抗凝试管中。②用毛细吸管吸取抗凝血在液面上ｌｃｍ处沿管壁徐徐加入预先加有５ｍＬ淋巴细胞分离液的无菌试管，以２０００ｒｐｍ的速度离心２０ｍｉｎ，沿管壁周缘吸取淋巴细胞分离液及血浆层之间的单个核细胞（ＰＢＭＣ）。⑨ｖＢｓ液洗涤２次，分别以１５００ｒｐｍ、１５ｒａｉｎ和１０００ｒｐｍ、１０ｒａｉｎ离心，观察计数，用ＲＰＭｌｌ６４０培养基调整细胞浓度至１×１０７／ｍＬ。（２）外周血单核细胞的分离：采用玻璃器皿吸附法分离淋巴细胞悬液，将分离的外周血单个核细胞悬液倾入玻璃平皿中，３７℃静置２ｈ，用毛细吸管轻轻吸取未黏附的细胞悬液备用，尖吸管吹打贴壁的细胞，即为外周血单核细胞，用ＲＰＭｌｌ６４０培养基调整细胞浓度至ｌＸ１０６／ｍＬ。（３）外周血Ｔ淋巴细胞的分离：①尼龙棉柱的制备”１：将尼龙棉先用Ｏ．２ｍｏｌ／Ｌ盐酸浸湿５ｈ，用双蒸水冲洗后置于烧杯内，加双蒸水煮沸１０ｍｉｎ，置于漏斗内滴干，重复上述过程６次（最后两次用去离子水）。称取尼龙棉５００ｍｇ，将其仔细撕开，梳整，使其松散均匀，装入５ｍＬ注射器内。同法制备５０只尼龙棉柱，高压灭菌消毒待用。②尼龙棉柱法分离Ｔ淋巴细胞：将制备好的尼龙棉柱用预温的细胞培养液浸润，关闭阀门，３７℃静置３０ｒａｉｎ，ＰＢＳ液和ＲＰＭｌｌ６４０细胞培养液各５ｍＬ洗柱，洗毕将上述淋巴细胞悬液１札加入尼龙棉柱内，关闭阀门，平放尼龙棉柱，３７＂Ｃ孵育ｌｈ，然后用３７℃预温的含１０％ＦＢＳ的ＲＰＭｌｌ６４０培养液５ｍＬ洗柱２次，流速为ｌ滴／ｓ，洗脱液中富含Ｔ淋巴细胞，收获Ｔ淋巴细胞，调整细胞数至１×１０６／ｍＥ。（４）台盼兰染色法鉴定Ｔ淋巴细胞活性：取２滴细胞悬液加ｌ滴２％台盼兰染液，５ｍｉｒｌ后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色，计算活细胞百分率。本实验的细胞活力均在９５％以上（见图３）。３、角质形成细胞、单核细胞的灭活。在接种于２４孔板的角质形成细胞中，以ｌＸ１０５／孔加入外周血单核细胞，经３０Ｇｙ６０Ｃｏ－ｙＩ７Ｉ射线照射灭活。４、灭活的角质形成细胞、单核细胞与Ｔ细胞共培养在灭活的角质形成细胞、单核细胞培养孔中分别加入Ｊ下常人、银屑病患者Ｔ细