刺五加、重组人促红细胞生成素对新生大鼠高氧肺损伤影响.docxVIP

延边大学硕士学位研究生毕业论文材料与方法２．３．２刺五加组：Ｏ．０２ｍ垤，每日１次腹腔内注射。２３．３ｒｈＥＰＯ组：４０００ｕ，ｌｑｇ，每日１次腹腔内注射。２．３．４给药时间：制备模型后２４ｈ起，每天同一时间给药。２．４取材方法在制备模型后第３、７、１４天，每组选１０只动物，用ｌＯ％水合氯醛Ｏ．２咖腹腔内注射后，四肢固定于按板上，切开胸腔暴露心脏、肺、气管、支气管，用穿刺针穿入右心室同时将左心耳切开，灌入肝素化的生理盐水至左心耳处流出清亮液体为止，取心脏，气管插管后自气管缓慢注入Ｏ．５．１．ＯＩＩｌｌ生理盐水至出现阻力，保留３０ｓ后抽出，重复灌洗３次，收集支气管．肺泡灌洗液，离心１０Ｉｎｉｎ（４０００ｒ／ｍｉｎ），取上清液保存，而后自气管缓慢注入４％多聚甲醛至双肺尖刚刚彭起为止，以固定肺组织，取双肺组织用ｌＯ％多聚甲醛固定，４８ｈ后常规石蜡包埋。２．４．１ＭＤＡ检测：用硫代巴比妥酸法测定ＭＤＡ，严格按照说明书操作，取Ｏ．２ｍｌＢＡ】Ⅲ的上清液及等量ｌＯ衄ｏⅣｍＩ标准品、无水乙醇、试剂一，用旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，９５℃水浴８０分钟，取出冷却，然后４０００转／分，离心１０分钟，使沉淀完全，用移液器取上清液加入比色皿中，避免倾倒，５３２ｍ处，１锄光径，测吸光度，根据所给公式，计算ＭＤＡ含量。测定中试管要干净（试管内的金属离子影响结果），加入试剂混合要均匀，试剂和待测标本从冰箱取出后应在室温至少放置３０ｍｉｎ。２．４．２免疫组化染色２．４．２．１免疫组化染色的ＳＡＢｃ法主要步骤如下；１．二甲苯Ｉ２．二甲苯ＩＩ３．无水乙醇Ｉ４．无水乙醇ＩＩ５．９５％乙醇６．８５％乙醇７．７５％乙醇８．蒸馏水ｌＯ分钟１０分钟５分钟５分钟５分钟５分钟５分钟５分钟９．３０％Ｈ２０２１份＋蒸馏水９份混合，室温５．１０分钟，蒸馏水洗３次。．６．延边大学硕士学位研究生毕业论文材料与方法１０．将切片浸入０．ＯｌＭ枸橼酸盐缓冲液（ＰＨ６．Ｏ），微波炉加热至沸腾后断电，冷却后ＰＢＳ（ＰＨ７．２．７．６）洗涤２次。１１．滴加５％ＢＳＡ封闭液，室温２０分钟。甩去多余液体，不洗。１２．滴加以ｌ：ｌｏｏ稀释的Ｃ１‘ＧＦ、ｎ吓吨一抗，３７℃ｌｈ。ＰＢＳ（ＰＨ７．２．７．６）洗２分钟×３次。１３．滴加生物素标记羊抗兔ｋＧ３７℃孵育２０分钟，ＰＢＳ（ＰＨ７．２?７．６）洗２分钟×３次。１４．滴加ｓＡＢＣ复合液３７℃孵育２０分钟，ＰＢＳ（ＰＨ７．２．７．６）洗５分钟ｘ４次。１５．ＤＡＢ显色：取１Ｉｎｌ蒸馏水，加试剂盒中Ａ，Ｂ，Ｃ试剂各ｌ滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。１６．苏木素轻度复染，蒸馏水洗涤。１７．７５％乙醇１８．８５％乙醇１９．９５％乙醇２０．无水乙醇Ｉ２１．无水乙醇Ｕ２２．二甲苯Ｉ２３．二甲苯Ⅱ２４．封片５分钟５分钟５分钟５分钟５分钟１０分锌ｌＯ分钟２．４．２．２ＳＰ方法主要步骤如下：１．石蜡切片脱蜡、脱水后（与ＳＡＢＣ法步骤１．７相同），用ＰＢＳ冲洗３分钟×３次。２．３０％Ｈ２０２抗原修复。３．每张切片加一滴过氧化酶阻断溶液（试剂Ａ），室温下孵育ｌＯ分钟，ＰＢｓ冲洗３次。４．除去ＰＢＳ液，每张切片加一滴正常非免疫动物血清（试剂Ｂ）室温下孵育ｌＯ分钟。５．除去血清，每张切片加一滴ＣＣ．１０一抗室温下孵育６０分钟。６．ＰＢｓ冲洗３分钟×３次，除去ＰＢｓ液，每张切片加一滴生物素标记的二抗（试剂Ｃ）室温下孵育ｌＯ分钟，ＰＢＳ液冲洗３次。延边大学硕士学位研究生毕业论文材科与方法７．除去ＰＢＳ液，每张切片加一滴链霉菌抗生物素～过氧化物酶溶液（试剂Ｄ），室温下孵育１０分钟，ＰＢｓ液冲洗３次。８．除去ＰＢｓ液，每张切片加２滴新鲜配制的ＤＡＢ液，显微镜下观察３．１０分钟。９。自来水冲洗，苏木素复染，ＰＢＳ液冲洗返蓝。ｌＯ．脱水、二甲苯透明，中性树胶封片（与ｓＡＢＣ法１７．２４相同）。２．５观察指标（１）ＨＥ染色后在光镜下观察肺组织改变。（２）按照ＭＤＡ试剂盒说明书，取Ｏ．２ｍｌＢＡＬＦ的上清液及等量ｌ０Ｉ】衄ｏｎＩｌｌ标准品、无水乙醇、试剂一，用旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，９５℃水浴８０分钟，取出冷却，然后４０００转，分，离心ｌＯ分钟，使沉淀完全，用移液器取上清液加入比色皿中，避免倾倒，５３２ｎｍ处，１锄光径，测吸光度，根据所给公式，计算ⅫＤＡ含量。测定中试管要干净（试管内的金属离子影响结果１，加入试剂混合要均匀，试剂和待测标本从冰箱取出后应在室温至少放置３０ｍｉｎ。（３）ＣＣ．１０阳性细胞的记数：每张切片取３个视野在高倍镜下计数ｃＣ．１０阳性细胞数，取平均值。（４）ＣＴＧＦ、ｎ师吨评分：根据ＣＴＧＦ和ＴＮＦ吨的免疫组化染色强度进行半定量评分，标准【３１为：Ｏ分：细胞未着色；１分：散在细胞着色（浅黄色）；２分