内参PCR法在布鲁氏菌病诊断中的应用.pdfVIP

中国动物检疫 2010年第 27卷第 5期 一55一 内参PCR法在布鲁氏菌病诊断中的应用 李 博 ，易新萍 ，叶 锋 ，，刘丽娅 ，吐尔洪江 ·努尔 ，谷文喜 ’，闫晶华 。，李金平 。，钟 旗 ’ (1．新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000； 2．新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；3．新疆动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830000) 摘 要：本试验以布鲁氏菌致病力因子VirB7下游至 VirB9上游基因序列为 目的扩增片段 ，设计上、下游引物， 优化血样、奶样 中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法，建立布鲁氏菌内参PCR(IR-PCR)检测方法，用于血液、奶液样本 中布鲁氏菌的检测。结果显示，内参PCR法有效地降低 了PCR法诊断布鲁氏菌的假阴性率，且检测结果与常规的布 鲁氏菌的诊断方法(细菌培养分离鉴定、iELASA)一致，该方法不仅提高了常规布鲁氏菌诊断方法的效率及灵敏度 ， 而且降低了其假阴性和假阳性率。对血样、奶样的检 出量分别为 35CFU／mL、350CFU／mL，适合于血样、奶样中布鲁氏 菌的检测。 关键词：布鲁氏菌；内参PCR法；检测 中图分类号：$855．99 文献标识码：B 文章编号：1005—944X(2010)05—0055—03 布鲁 氏菌病 (Bruce1losiS)又称 存；布鲁 氏菌 B．suis—VirB8缺失株 526bp，布鲁 氏菌株特异性扩增片段 马尔他热或波状热，是 由布鲁氏菌属 (内参菌株)由本室保存。 为 1276bp。 (Bruce1la)引起的人畜共患 自然疫 1．1_2 样 品 阴性参照无菌抗凝血 1．2．2．2 样 品DNA制备 血样参照 源性传染病。布鲁氏菌可感染人类、 样由本室冷冻保存，阴性参照无菌奶 Qiagene公司试剂盒说 明书 (DNeasy 多种家畜和野生动物，引起相似的临 样购 白新疆某乳制品公司；抗凝血样 TissueKit)提取DNA；奶样参见文献 床症状与病理损伤，如发热、流产与 和奶样采 自新疆某牛场。 方法提取奶样 DNA。 不育、慢性关节炎及神经损害。人类 1．1．3 主要试剂 1．2．2．3 PCR反应 PCR反应体系为 感染布病后 ，由于其病程长，反复发 TaqDNA 聚合酶 (广 东东盛 ， 50uL，由 l0×PCRBuffer(含 Mg 作，长期不愈而导致 巨大的经济损失 5u／uL)，Tryptic soy broth (Bec— 5uL、2．5mM dNTP 1uL、上 、下游 弓I 和严重的公共卫生 问题 [1]。 ton， Dickinson and Company)， 物 (20mM／L)各 luL、Taq酶 (5U／laL) 本研究将布鲁 氏菌 VirB8缺失 DNeasyTissueKit(Qiagene)，RNase 0．2 L、模板 DNA 1 L、超纯 水 株作为内参株混合于被检样品中，以 A、蛋白酶K购 自大连宝生物工程有 40．8 L组成。PCR反应程序为95℃ 布鲁氏菌致病力因子 VirB7下游至 限公司。布鲁氏菌快速间接酶联免疫 预变性 l0分钟 ：94℃变性 30秒 、 VirB9上游基因序列为 目的扩增片 吸附实验 (iELISA)抗体检测试剂盒 55℃退火 30秒 、72℃延伸 1分钟 ，30 段，进行 IR—PCR扩增 ，根据扩增条带 购 自哈尔滨平河生物技术有限公司。 个循环；72℃延伸 1O分钟；4℃保存。 数 目及大小检测并鉴定样品是否被 内参PCR引物 由上海生工生物工程 1．2．2．4 内参菌量 的测定 将布鲁 布鲁氏菌属感染，并与常规的布鲁氏 技术有限公司合成。 氏菌 牛种 标 准 2308、B．suis—VirB8 菌的诊断方法 (细菌培养分离鉴定、 1．2 试验方法 缺失株分别接种于液体 TS培养基， iELASA)做了比较。实验结果表明该 1．2．1 内参制备 将 1001．tLB．SU— 37℃温箱培养。当OD600~O．6时，对 方法有效地避免检测过程中人为操