发菜中GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因的克隆及原核表达.docVIP

发菜中GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因的克隆及原核表达 蔡国强 陈雪峰 范华 刘欢 赵圆圆 陕西科技大学食品与生物工程学院 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 发菜 (Nostoc flagelliforme) , 是一种陆生蓝藻, 生长环境恶劣, 具很强的抗逆性, 其分泌的胞外多糖具有极高的食用和药用价值, 但其合成机制尚不清楚。前期工作采用RNA-Seq技术对高盐胁迫下的发菜样品进行转录组测序, 发现GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因转录水平较正常培养条件上调2.18倍。基于转录组测序结果, 通过同源相比对分析设计引物, 以发菜基因组为模板克隆GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因, 获得长度为1080bp的核酸序列。通过生物信息学分析表明, 该基因具有较高保守性, 蛋白质二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋, 是亲水性蛋白, 酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点个数分别为13、15、17, 蛋白质分子量为41.08 kDa, 等电点为5.73。正负电荷氨基酸残基数分别为38和46。随后, 将该基因插入质粒p ET-28a中成功构建重组表达质粒, 然后转化至BL21大肠杆菌感受态中进行原核表达。在OD值为0.8时, 用1 mmol/L IPTG在16℃下诱导表达20小时后, 获得预期大小重组蛋白 (41.08 kDa) 。本研究首次成功克隆得到发菜GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因, 并成功构建重组表达质粒于大肠杆菌高效表达, 研究结果为进一步研究发菜多糖代谢分子调控机制奠定了基础, 也为今后GDP-甘露糖4, 6-脱水酶基因工程菌株的构建提供理论依据。 关键词： 发菜; 盐胁迫; GDP-甘露糖; 4, 6-脱水酶基因; 克隆; 原核表达; 作者简介：蔡国强, 研究生, 研究方向为发菜多糖相关片段的克隆表达。E-mail:540539110@ 作者简介：陈雪峰, 教授, 博士生导师, 研究方向为食品生物技术。E-mail:chenxf@ 收稿日期：2017-09-06 基金：国家自然科学基金委员会生命科学部2014年度青年基金项目 Gene cloning and prokaryotic expression of GDP-mannose 4, 6-dehydratase from Nostoc flagelliforme CAI Guo-qiang CHEN Xue-feng FAN Hua LIU Huan ZHAO Yuan-yuan School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology; Abstract： Nostoc flagelliforme is a terrestrial cyanobacteria with stress-tolerance, which lives in poor condition. And the extracellular polysaccharide produced by Nostoc flagelliforme is proved to be with high edible and medicinal value. It was found in the previous work that the transcription level of gene encoded for GDP-mannose 4, 6-dehydratase increased 2.18 times in Nostoc flagelliforme cultured under high salt concentration contrast to the control by RNA-Seq technology. Based on the transcriptome sequencing result and the homologous blast, the primer was designed and the genome of Nostoc flagelliforme was utilized as template to clone the gene encoded for GDP-4, 6-mannose dehydratase. The sequence with the size of 1080 bp was successfully obtained. According to the b