第三章 植物细菌病害研究法.pptVIP

2.培养基种类 培养基可根据所含成分、物理状态、以及不同的使用目的等而分成若干类型。 按照培养基的成分来分： 　　(1)合成培养基。由各种成分完全已知的化学物质组成的培养基。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。 　　(2)天然培养基。由天然物质制成的培养基。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤。 　　(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 按照培养基的物理状态分： 　 (1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。 　　(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。 　　(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。 按照培养基用途分： 　　(1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。 　　(2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 　　(3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。 ①分离细菌常用培养基 肉汁冻培养基(NA) 马铃薯葡萄糖(或蔗糖)培养基(PDA) ②属和种的选择性培养基 采用选择性培养基可以有效得分离植物病原细菌，比如荧光假单胞菌通常用KB，胡萝卜软腐欧氏杆菌采用结晶紫果胶酸盐培养基(CVP)，放线菌用高氏Ⅰ号培养基等。 所有这些选择性培养基都含有抑制杂菌生长的化学物质如抗生素、放线酮、重镉酸钾等，从而获得所需要的病原菌。 3.单菌落的选取 经过分离后，要正确选取单菌落，通常在平板上菌落形态、大小比较一致的、且在数量上占优势的菌落即为所要分离的病原细菌。 假如对所分离的细菌性状不清楚的话，可以选择不同培养性状的菌落分别进行培养，然后测定其致病性，以确定所分离得到的单菌落是否为真正的致病菌株，有目的的进行保存。 二、植物病原细菌的培养性状 (一)培养性状的描述 固体：①平板：形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等 ②斜面：菌苔的形状分为丝状、念珠状、薄膜状、分枝状和假根状等 半固体 ：观察菌苔是否沿接种线向四周蔓延或仅沿接种线生长，或只在上层生长很好，底部很少生长等。 液体：观察液体呈现浑浊、絮状、形成菌膜、上层清晰底部出现沉淀等 (二) 细菌的色素 ①非水溶性 ②水溶性 (三) 细菌的计数 ①测数计计数法； ②混浊度计数法； 1％的氯化钡溶液和1％硫酸溶液 ③平板菌落计数法。 (四) 细菌的保存 传代培养法 矿物油下保存 干燥保存 在灭菌的土壤、沙土或硅胶中，室温下干燥后保存于冰箱中 冷冻干燥保存法 低温法（-70～-80℃）和液氮法(-196℃)，并加入保护剂如甘油、PVP、二甲亚砜等 悬液法 蒸馏水、蔗糖、葡萄糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水中 (五) 细菌的培养 一般放置在25-30℃的恒温培养箱中培养，棒形杆菌生长所需温度较低23~25℃更适合，要每天检查细菌的生长情况。 第三节 植物病原细菌的致病性测定 （一）烟草过敏性反应(HR)的测定 在烟草上接种后，呈现过敏性反应的菌株为致病菌，否则为腐生 菌。通常只有烟草的非致病性菌株才会产生过敏性反应。能对烟 草致病的细菌如野火病菌，在烟草上形成典型的野火病症状。 (1)测定方法 配制107-108CFU/ml的细菌悬浮液，用注射针将细菌从烟叶下表皮 注入叶肉细胞间，选用未开花的烟草植株(whiteburley或Hicks品 种)，用无菌水作对照。一般接种的烟草植株应保持在25℃， RH85%，24-48h表现枯斑的为阳性反应，3d左右出现黄斑为阴性反 应。 (二) 利用离体植物组织测定致病性 在试验过程中，有时由于试验材料的有限性和试验取材的不方便，通常采用离体植物组织来测定植物病原细菌的致病性。 通常是选用易感病品种的幼嫩组织，洗净晾干后用70%酒精擦洗，待其干燥后，用蘸有细菌液的