PCR测序等临床应用.ppt

分子诊断技术在临床上的应用;;新技术在临床诊断上的应用： 一、聚合酶链反应 二、组织配型技术 三、荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ） 四、STR技术 五、单核苷酸多态性(SNP) 六、ＤＮＡ测序技术 七、基因芯片技术等;PCR技术在临床检验中的应用;;reverse primer; 模板DNA样品的处理 ;PCR技术的分类 ;免疫PCR（I-PCR）;套式引物PCR（Nested PCR）;反转录 PCR(RT-PCR) ;反向PCR (Reverse PCR);不对称PCR（Asymmetric PCR）;定量PCR;锚定PCR（Anchored PCR） ; PCR技术在医学上的应用 ;病原体的检测; 常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。 我国是乙肝高发区，乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。故通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其他传染途径存在的可能。; PCR方法检测乙肝的优势： 1 早期诊断 敏感 可在感染潜伏期检出 2 对低持续感染乙肝病人的诊断 3 疗效跟踪及病程判断 ; 丙肝病毒是RNA病毒，丙肝病毒的分离尚未成功，目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于包被的抗原是人工合成的，与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性和假阴性的。RT-PCR技术使这些困难得到解决。; 在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌所引起的胃炎、胃溃疡等。幽门螺旋杆菌是通过口-口途径传播并定位于胃黏膜上皮细胞。故通过PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出，减少病人的痛苦。; 呼吸系统感染性疾病：肺结核、非典型性肺炎等。 结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用上受到限制。 PCR法简便、敏感、特异。一般认为样本中只要有100个左右的结核菌即可被检出。; 循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表性。如柯萨奇病毒等。RT-PCR检测，应注意标本的保存。 外在环境富存大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。; 性病诊断中应用广泛 淋病双球菌、解脲衣原体、沙眼衣原体、梅毒螺旋体等用PCR方法诊断。;PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用 遗传性疾病根据其遗传方式可分为单基因、多基因和染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查、生物化学分析等。PCR在遗传病诊断应用中，可利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制性内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较广泛的有地中海贫血、苯丙酮尿症、血友病及性别鉴定等。; 地中海贫血：是世界上最常见的单基因遗传病，在我国发病率为0.66%，广州、广西等地高发可达10%。应用PCR技术可直接检测突变的基因诊断此病。 苯丙酮尿症：是一种常染色体隐性遗传病，病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化，出现脑组织损伤，智力障碍。本病患者应低苯丙氨酸饮食治疗，但非常昂贵，关键应避免出生。故早期诊断极其重要。;镰形细胞贫血 由于基因突变而引起Hb的结构异常，正常人Hb的β珠蛋白链第6位上谷氨酸被缬氨酸代替而形成血红蛋白S(HbS)所致。 Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段扩增，扩增产物用限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段，191和103bp，镰形细胞贫血的纯合子，仅有一个片段294bp，杂合子有191、 103和294bp 3个片段。;杜氏营养不良症（DMD）;甲型血友病是最常见的遗传性凝血功能障碍所致的出血性疾病，为X性连锁隐性遗传（女性传递，男性发病），在男性中发病率为万分之一。 另外，对于有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血压、一些肿瘤疾病，也是当前研究的热点及难点，可望近期有所突破。;肿瘤基因的检测和诊断 ; 原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理： 1 点突变 受到射线、化学因素、生物因素的诱导。 2 获得启动子 原癌基因从病毒基因