病原菌交叉免疫反应蛋白的初步研讨.pdf

福建蠹q 第三届海洋生物育技术论坛 2005．08．19-23 病原菌交叉免疫反应蛋白的初步研究 黄传钟+，张丹风，吴丽娜，任海霞，王三英，彭宣宪宰 (厦门大学生命科学学院， 厦门361005) 摘要：报道病原菌之间特别是杆菌与海洋性弧菌之间的抗原交叉免疫反应。利用新近发展起来 的免疫蛋白质组学和生物信息学的方法确定交叉抗原，从而为制备通用疫苗以及研究交叉免 疫反应的机理奠定基础。 关键词海洋性弧菌；交叉免疫；免疫蛋白质组学；生物信息学 海洋性弧菌均是嗜盐菌，部分海洋性弧菌会使鱼虾感染弧菌病，对养殖业造成巨大损失。 海洋性弧菌有些种类如副溶血弧菌、创伤弧菌同时是人体致病菌，尤其是有肝、肾、以及免 疫低下等疾病患者，若感染易导致死亡。目前，创伤弧菌与霍乱弧菌、肠炎弧菌并列为造成 人类感染的3大弧菌，在我国每年夏天都曾造成多起死亡个案。因此对于如何控制预防这些 弧菌病以及相关的研究有重大意义。 本文通过免疫蛋白质组学和生物信息学的方法，利用E．coliK12部分外膜蛋白制备的抗 体与E．coli0157、E．coliEPEC、创伤弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌的外 膜蛋白以及金黄色葡萄球菌的膜蛋白进行交叉免疫反应，得到的交叉抗原用MALDI。TOF质 谱鉴定，并通过生物信息学的方法进一步确定。 1材料与方法 1．1 E．coli Buffer 菌体，用生理盐水洗涤后，重悬在】O．15mL mol／L磷酸盐，10 D(8mol／L尿素，0．1 mmol／L Tris．HCI，pH mol／L 该混合物上柱，并收集流出液；用5倍的菌裂解液体积的BufferE(8mol／L尿素，0．1 磷酸盐，10mmol／LTris—HCl，pH mol／L 磷酸盐，10mmol／L 5．9)浸泡5min后再慢慢流出收集洗脱液(4—5s每滴)， Tris．HCl，pH BufferG(8mol／L尿 冉重复三次同样的洗脱，共收集4管BufferF的洗脱样品；加入lmL 素，0．1mol／L磷酸盐，10mmol／L 4．5)浸泡5min后再慢慢流出收集洗脱液 Tris．HCl，pH (4～5s每滴)，再重复3次同样的洗脱，共收集4管BufferG的洗脱样品；SDS—PAGE分析 收集的各组分。 717 覆建霞订 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19-23 1．2抗体制备参考文献【1，2】进行。简述如下，将纯化后的10种蛋白分别与福氏完全佐剂1 ：1充分混合形成油包水状态，于兔大腿内侧肌肉免疫注射0．5mL(500肛g)；首次免疫后第 3周进行第2次免疫，采用不完全佐剂，注射量不变；再隔3周免疫第3次，采用不完全佐 剂；10天后耳静脉取血采用Dot—ELISA法测效价，效价满意后，第2天放血。血．液4。C静置 过夜后分离血清，分装，．80。C保存。 1．3外膜提取参考文献【3]进行。简述如下，挑取各试验菌的单菌落接种于液体培养基中， 心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体1次；收集的菌体加入超声波破碎缓冲液(50mmol／L oC离心15rnin，收 Tlis—HCl，pH7．5)，悬浮，冰浴超声破碎，输出功率50％；破碎后50009 4