海洋真菌H3代谢产物偏苯三酚细胞毒活性研讨.pdfVIP

福建覆日 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 海洋真菌H．3代谢产物偏苯三酚细胞毒活性研究+ 陈融黄耀坚郑忠辉宋思扬冰 (厦门大学生命科学学院，细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室， 福建厦门361005) 摘要：本文对从真菌Aschersonia sp．次级代谢产物中分离到的化合物偏苯三酚的细胞毒活性进行 了试验，并应用新兴的蛋白质组技术分析了其对人骨肉瘤细胞系MG一63抑制作用的机理，经蛋 白质2一D电泳，以MALDI—TOF对差异蛋白点进行肽指纹图谱测定，经网上数据库检索，查知 p2】蛋白激活因子和细胞黏附调控因子。已 3个点差异蛋白点。它们分别为D．肌动蛋白．RAS 有文献报道该化合物具有抑制细胞微管蛋白聚合的活性，综合本实验的结果说明该化合物可能 通过抑制细胞黏附因子，从而影响了细胞内的肌动蛋白相关的微管结构。同时，该化合物还可 能具有抑制GTP酶，使ras蛋白处于非激活状态，最终抑制细胞的增殖的作用。 关键词：偏苯三酚；人骨肉瘤MG．63细胞系；肽指纹图谱 海洋微生物含义广泛，资源丰富，海洋性植物木栖真菌为其中一个群类。这类真菌生活在 植物体表或体内。由于这一环境相对贫瘠，I捌此此类真菌具有分离和筛选出活性物质的潜力。 而对已知化合物的活性测定可以为药物先导化合物的开发和利用提供依据。 目前化合物偏苯三酚的已知细胞毒活性产生机理多集中在其对核酸物质的作用方面。本文 应用蛋白质组学方法，从蛋白质表达情况角度对该化合物细胞毒活性进行了研究，发现了未见 报导的偏苯三酚与肿瘤细胞蛋白质可能的作用途径，为深入研究该化合物的生物活性机理奠定 了基础。 l材料和方法 1．1材料真菌菌株H一3分离福建九龙江口浮宫草埔头红树植物桐花树树皮。经鉴定为赤座梭 孢属(Aschersonia sp．)真菌。化合物偏苯三酚分离自菌株H一3发酵液的乙酸乙酯萃取物。受试 肿瘤细胞株人口腔表皮样癌KB细胞，人成骨肉瘤MG一63细胞，人B淋巴瘤Raji细胞购自中 国科学院上海细胞研究所。其它试剂如无特别说明，均购自上海生工生物工程技术服务有限公 司。 1．2方法 1．2．1化合物体外细胞毒测定抗肿瘤活性的细胞毒采用MTT法测定…：把培养好的肿瘤细胞 C02培养箱中，37培℃培养24h后加入完全培养基稀释的样品20此，继续培养72h后取出，加 h，加 入100此的10％SDS一0．01N 依照下式计算抑制率，抑制率为50％的样品所稀释的倍数为∞卯。 +国家“863”计划项目(2003AA624010)福建省科技计划项目(2004N003)资助 。通讯作者。Email：sysong@xmu．edu．cn 312 福建暖n 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 抑制率=(对照组OD值一实验组OD值)／对照组OD值x100％。 1．2．2偏苯三酚处理MG．63细胞和总蛋白提取MG．63细胞正常培养3d，待细胞大量贴壁后， 加入待测化合物的溶液，继续培养6h，以未经待测化合物处理的MG．63细胞培养物为阴性对 1000r／min离心 照。倾去培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞3次，将细胞移至离心管中。40C 10min，沉淀用lmL预冷的PBS悬浮，移入1．5mL离心管，4012 清。加入裂解缓冲液，300W超声破碎，每次30s，共3次。 18h。 1．2．3双向电泳第一向预电泳200V15min，300V30min，400V2h，上样后电压400V 等 电聚焦后迅速取出胶条，平衡后移至10％SDS—PAGE胶上继续电泳，其一端外侧加上标准蛋白 质，1％琼脂糖封固．电泳结束后