腺病毒介导心肌营养素-1对成年大鼠脊髓损伤的修复作用.docVIP

精品论文 参考文献 腺病毒介导心肌营养素-1对成年大鼠脊髓损伤的修复作用 1.广东省深圳市宝安区中心医院 深圳 518102 2.第三军医大学附属新桥医院 重庆 400037 [关键词]：大鼠；腺病毒；心肌营养素；脊髓损伤；修复 本研究用大鼠C3脊髓外侧索横切模型，腺病毒载体直接注射，观察心肌营养素-1( CT-1)对红核神经元的存活、红核脊髓束轴突再生和前肢功能恢复的影响。 1.材料与方法 1.1实验动物及分组 成年Wistar雌性大鼠，体重180-240g(大坪医院动物室提供)。随机分为5组：正常组(N)：正常动物；损伤组(GF)：SCI+明胶海绵（gel foam）+病毒缓冲液；病毒对照组(Adv-eGFP)：SCI+明胶海绵+Adv-Egfp；Adv-CT1组(Adv-CT1)：SCI+明胶海绵+ Adv-CT1。每组动物在1、4、8周Fluord-Gold (FG) (Fluorochrome,Inc.)观察神经元存活，4周Dextran,Biotin,10,000MW,lysine fixable (BDA-10,000) (Molecular Probes, D-1956)观察轴突再生，2、3、4周观察动物行为学，每个时间点4只动物。 1.2动物手术及观察 C3脊髓外侧索横切模型(C3Hx)：常规麻醉和暴露颈段脊髓，用微型锐利刀片C3脊髓背根下方2 mm垂直切下，并切除2-3 mm，形成约1times;2 mm2大小的空洞。这种切除范围包括整个外侧索(包含红核脊髓束)、部分腹侧索和前后角部分灰质，背侧索完整。 给药方式：病毒组：纯化病毒用10 mm Tris.HCl (pH7.4)稀释至107pfu/ml，用约5-10ul病毒液饱和明胶海绵，植入空洞。对照组：直接放入5-10ul 10 mm Tris.HCl饱和的明胶海绵。CT-1组：CT-1 100ug/ml饱和明胶海绵，放入空洞5 min，取出15 min后放入重新CT-1饱和明胶海绵，重复3次，最后再放入CT-1饱和明胶海绵。8-0丝线缝合硬脊膜，关闭伤口。术后肌肉20万U青霉素注射，分笼喂养。 FG注射：动物取材前3 d，动物重新麻醉。再生观察组暴露双侧C5外侧索，2%FG 1ul微电极(成茂会社，日本)缓慢注入。存活观察组暴露双侧C2外侧索，并分别注入1ul 2%FG。关闭伤口，3 d后取材。脑桥冠状面30 m冰冻切片(CM 1900, Leica)，红核长度大约1000 m，共30张切片左右，按顺序置于栽玻片上。每张切片于荧光显微镜(MPS1063, Leica )下紫色激发荧光观察FG标记的红核神经元，每张每侧标记的神经元计数。为避免过度计数，每张切片计数2次，取平均数。只有能辨认神经元细胞核、核仁和细胞形态神经元才可计数。计数时采取相邻切片对照观察，避免神经元重复计数。显微镜放大倍数为100倍。 BDA注射：动物取材前15 d，动物重新麻醉。动物置于立体定位仪(成茂会社，日本)上“零位”固定。切开颅顶皮肤，30% H2O2置于颅骨氧化颅骨缝，辩认前卤，牙科转颅骨开窗。微电极推进器(成茂会社，日本)控制玻璃尖端直径50 um的微电极。右侧红核定位：Bregma点向后5.8 mm，向外侧0.7 mm, 距颅骨深为7.4 mm (Paxinos G. The rat brain in sterotaxic coordinates. Academic press)。微电极缓慢刺入红核。注射参数：阳性脉冲直流电5uA, 频率为注射7s后停 7s；时间为30 min, 0.5ul 10%BDA。关闭伤口，分笼喂养，15 d后取材。脑切片30 um，脊髓切片25 um。按BDA试剂盒说明行BDA免疫组华染色。 1.3行为学试验 所有动物采用前肢的不对称试验观察行为的改变。评分行为、评分内容、评分标准根据文献严格执行。每组动物在试验后2、3、4周评分，每只动物观察时间为：正常前肢+伤肢+双肢靠壁时间=5 min。 1.4统计学处理 FG标记红核神经元计数用表示，行为学评分用正常前肢、伤肢、双肢靠壁时间的百分比表示。t-test检验两组间的差异。 2结果 2.1 FG神经逆行示踪 (1)红核神经元存活计数 SCI后在损伤区上一个节段双侧注射FG，FG逆行示踪标记的红核神经元作为神经元存活计数。发现双侧红核神经元均标记。在损伤后1-4周，标记红核神经元数几乎无变化。损伤后8周，损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组、Adv-CT1组标记神经元分别减少31%、29%、32%、19%。Adv-CT1组与损伤组相比，有显著性差异