钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用.docVIP

精品论文 参考文献 钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用 赵 岩 (广州南方医科大学生理教研室 510515） 【中图分类号】R605.971 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)23-0108-02 【摘要】目的 研究钙火花在重症失血性休克血管反应性中的作用。方法 应用激光共聚焦显微镜成像技术和细胞内记录正常和失血性休克2小时后大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞（arterial smooth muscle cell，ASMC）的钙火花和膜电位的变化。结果 休克组的钙火花荧光值比正常组的显著增高并且膜电位显著降低。结论 失血性休克2小时，钙火花和BKCa活动增强与ASMC细胞膜超极化密切相关。 【关键词】失血性休克 钙火花 休克是一个复杂的病理过程，晚期休克难治的重要原因之一是微血管丧失对升压药物的反应性。Cryer等也报道脓毒性休克时骨骼肌的微动脉舒张，正是这种小血管的舒张导致外周血管阻力下降，对缩血管物质的反应性减弱或消失，以致血压不能维持[1]。这种微循环的衰竭几乎在各型休克的末期都会发生，也是休克病人死亡率居高不下的重要原因之一，但其发生的确切机制尚未完全查明。 大电导钙激活钾通道BKCa在平滑肌上分布密度大（1-4个通道/mu;m2），作用广泛，在血管等平滑肌细胞，BKCa通道的活动则使细胞膜超极化，血管舒张。由于BKCa电导大，使得在较少通道被激活的情况下即可引起较大的超极化。因此，我们推测重症失血性休克血管低反应性与BKCa密切相关。细胞膜上几个或数十个BKCa同时激活形成自发性外向性电流（spontaneous transient outward current，STOC），研究发现脑血管平滑肌细胞中的局部钙离子浓度与STOC有关，并参与了血管平滑肌张力的负反馈调节过程[2]。钙火花是指肌浆网膜上一个或多个Ryanodine受体（RyR）共同活动所引起的钙释放的基本单位，它能够导致局部钙浓度的急剧升高。在心肌和骨骼肌细胞中钙火花直接介导细胞的兴奋－收缩偶联过程，在平滑肌细胞其功能较为复杂。因此，我们推测：休克后期细胞内局部钙即钙火花频率和幅度增加激活BKCa导致平滑肌细胞反应性的下降。 1.材料和方法 1.1 失血性休克动物模型的复制 取体重为170～220g的Wister大鼠（雌雄不拘），用13.3％乌拉坦＋0.5%氯醛糖（0.65ml/100g体重）肌肉注射麻醉，分离双侧股动脉和一侧股静脉分别用于测量血压、放血、回输血液和药品。将收缩压维持在40mmHg 约2 h，复制失血性休克大鼠模型。假手术组只做手术，不放血。 1.2 血管平滑肌细胞的分离 手术毕的动物断头处死，迅速剪取肠系膜取出肠系膜置于0℃无钙的HEPES缓冲液中（HPSS, mmol/L: NaCl 130, KCl 5, MgCl 1.2, CaCl2 1.5, HEPES 10, Glucose 10, 用1mol/L NaOH调pH至7.4），剥离肠系膜动脉并弃去其周围脂肪组织，置于含木瓜酶（papain: Sigma, St. Louis）0.3mg/ml, 二硫苏糖醇（DTT: Sigma, St. Louis）1.25mg/L的无钙HPSS液中，37℃温浴消化25 min，然后再置于含胶原酶XI（collegenase XI, Sigma, St. Louis）1mg/ml的低钙（0.1 mmol/L CaCl2）HPSS液中37℃消化10min。用吸管轻轻吸走消化酶液，保留血管段，再沿壁缓慢加入0℃的低钙HPSS液冲洗2～3次，最后加入适量低钙HPSS液，用细头吸管轻轻吹打3～5次，即可得到大量单个血管平滑肌细胞。将细胞悬液置于4℃冰箱中，6～8 h内分别完成细胞内钙的测定和对血管活性物质的反应性的实验。 1.3细胞内钙及钙火花的测定 在细胞悬液中，加入钙指示剂fluo-4AM（细胞内钙测定，终浓度5mu;mol/L），室温避光孵育30至40min，用正常HPSS液反复冲洗3～4次后，置于共聚焦倒置显微镜（Zeiss,德国）上，由氩离子激光器激发，在激发波长488nm、发射波长515nm条件下进行荧光强度检测，用xyt方式进行扫描，时间间隔5s，扫描时间为5min。分别记录基本荧光值（F）、加入5mmol/L EGTA螯合所有的细胞外钙离子时的荧光值（Fmin）和加入0.1%Triton使细胞内钙全部与指示剂结合时的荧光强度（Fmax），用下列公式计算细胞内钙离子浓度：〔Ca2+〕i（nM）＝K*（F－Fmin）/（Fmax－F）其中K