基因结构与功能分析-1.ppt

2. 双向电泳：分析蛋白质表达谱 可同时分离成百上千的蛋白质，可对差异表达的蛋白质进行鉴定。 第三节 基因的生物学功能鉴定技术 一、用功能获得策略鉴定基因功能 将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。 方法： 转基因技术 基因敲入技术 （一）转基因技术 （transgenic technology） 外源基因 导入 受精卵或 胚胎干细胞（ES细胞） 随机重组 外源基因插入基因组DNA 植入假孕个体子宫 外源基因随细胞分裂遗传给后代 基因打靶与转基因技术最大区别：前者能去除或替换生物体内固有基因，而后者则不能。 基因打靶是研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 （二）基因敲入 通过同源重组，用某一基因替换另一基因，或将基因片段插入基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。（靶向基因治疗） （gene knock-in） 基因打靶（gene targeting）的一种。 基因敲入 基因敲入 基因敲除 点突变 缺失突变 染色体大片段删除 基因打靶：按预期方式准确改造生物遗传信息的一种实验手段。 二、用功能失活策略鉴定基因功能 将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。 方法： 基因敲除 基因沉默 通过同源重组，在ES细胞中定点破坏某内源基因，利用ES细胞发育的全能性，获得某基因缺陷的杂合子，通过遗传育种获得该基因缺陷的纯合个体。 （一）基因敲除 条件性基因敲除可更精确地在时间和空间上敲除基因，理论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。 （gene knock-out） 基因打靶技术的一种 （基因功能完全缺失 ） Cre：位点特异性重组酶，介导2个LoxP之间的特异性重组 在特定阶段 （二）基因沉默 1. RNA干扰（SiRNA） 2. miRNA 3. 反义RNA 4. 核酶（ribozyme） 短时间内高效特异地抑制靶基因表达 通过与mRNA不完全互补配对而抑制翻译，一种miRNA可沉默多个靶基因。 通过反义RNA与细胞中mRNA特异性结合而抑制相应mRNA的翻译。 通过剪切靶RNA分子而抑制基因的表达。 （基因功能部分缺失） 在转录或翻译水平阻断某基因的表达 三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能 通过物理、化学诱变或生物技术产生大量的基因组DNA突变。 乙基亚硝基脲（ENU）是一种高效的化学诱变剂：DNA碱基烷基化修饰，复制错配而诱发单碱基突，造成单个基因发生突变。 基因捕获（gene trapping）技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段 转基因、基因打靶、基因沉默的局限： 机体代偿，异常表型不明显；个体胚胎期死亡；特异性启动子缺乏；基因的不同位点突变可能导致不同表型等。 ENU处理小鼠→精子细胞突变→产生突变表型→筛选，得突变系小鼠→研究得知：突变基因定位，突变序列，基因功能 CIAP:小牛肠碱性磷酸酶 TAP:烟草酸焦磷酸酶 * 目录 目录 第二十二章 基因结构与功能分析技术 The Analysis Technology for Gene Structure and Function DNA序列测定 基因转录起点及其启动子的分析 基因编码序列的分析 基因拷贝数及其表达产物的分析 基因功能获得和/或缺失策略 随机突变筛选策略 第一节 基因结构分析技术 一、基因一级结构解析技术 基因的一级结构：脱氧核苷酸的排列顺序 解析一级结构最精确的技术：DNA测序 （DNA sequencing） （一）双脱氧法和化学降解法 ——两种常规的DNA测序方法 Sanger双脱氧测序（dideoxy sequencing）法 Maxam-Gilbert化学降解测序法 （二）全自动激光荧光DNA测序技术 ——原理基于Sanger双脱氧法 4种不同荧光染料 2. 四色荧光法： 标记 同一引物或4种不同ddNTP 4种不同颜色DNA片段 样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳 1. 单色荧光法： 单一荧光染料 标记 引物5′-端或dNTP 所有DNA片段均带同一种荧光标记 样品的4个反应产物分别在4个不同泳道内电泳 （三）焦磷酸测序—— 基于发光法测定焦磷酸的测序技术 5’磷酸化硫酸腺苷（APS） 荧光素 反应体系： DNA聚合酶 ATP硫酸化酶 荧光素酶 ATP双磷酸酶 酶 底物 某种dNTP ppi （每轮加入) 剩余的被降解 （