第三章细胞生物学研究方法文件材料.ppt

第三章  细胞生物学研究方法;;2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。;普通光学显微镜光路图;3、主要的性能参数; ——sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05～0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ——普通光线的波长为400 ～ 700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。;5、观察标本的制备：;第一步. 固定(fixation) 目的：使大分子交联而保持固定，不至在后面过程中移位或丢失。 试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。 第二步. 脱水;第三步. 包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步. 切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 ?m ;荧光显微镜光路图;3. 荧光的观察: 1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素。 2.二次荧光 ?? 非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生荧光（二次荧光），以便于进行观察 。;3.抗体荧光技术 ?? 带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合，这样就能通过抗体结合的荧光观察到抗原。 4.绿色荧光蛋白 ;;;图示： 鼠主动脉平滑肌的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red ;;200ng/ml ADM 处理BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光观察;⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。;;;⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位 b.观察过氧化物酶体;;载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察 待定蛋白质在细胞内的位置分布 ;;;观察过氧化物酶体;（三）激光共聚焦扫描显微镜 （Laser confocal scanning microscope, LCSM）;; 显微CT?;分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的3倍。 应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建;;;（四）相差显微镜;⑴普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法用人眼观察。 ⑵相差显微镜 细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即图像的明暗差。 ;;倒置相差显微镜;培养中的上皮细胞; 在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。 ——制造暗视野显微镜的灵感 ;分辨率： 典型的动物细胞——— 10～20 ?m 一般的细菌和线粒体—— 0.5?m (500nm) 普通显微镜 ———— 0.2μm(200nm) 暗视野显微镜———— 0.004-0.2μm(4-200nm) 应用： 能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及液体介质中的细菌等微粒的运动 。;;显微电影摄影 —记录细胞或细胞器运动过程和速度;（六）微分干涉显微镜;荧光共振能量转移原理图;（八）荧光漂白恢复技术(FRAP);二、电子显微镜;透射电镜;;2. 透射电镜生物标本制作：;(4)包埋：为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片：电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细胞的1/200厚度。 (6)染色：生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力