Survivin的表达和功能研究.docVIP

Survivin的表达和功能研究 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(5):54—57 Survivin的表达和功能研究 廖玉华殷秀飞 (浙江养生堂天然药物研究所杭州310007) 摘要利用RT..PCR方法确认了Survivin基因在4周胎肝,胎脾,胎肾cDNA文库中,乳腺癌,胃 癌,结肠癌组织中的表达,而在正常的肝组织中未见表达;利用分子克隆方法构建了重组表达质 粒pBV220..Survivin,并在DH5a菌株中成功表达了具有生物学活性的Survivin蛋白,体外检测到该 重组蛋白与RhSmac具有良好的结合活性;经脂质体转染重组Survivin蛋白的L929细胞与对照相 比具有更好的存活率. 关键词Survivin表达活性功能 中图分类号Q789 Survivin是一种结构独特的lAP(inhibitorofapoptosis) 家族成员分子,蛋白含142个氨基酸,分子量为16.5kDa, 只有单一的BIR功能区和Ring结构.Sun@in是一个双 功能蛋白,一方面表达于胚胎和发育的胎儿组织,但不 见于终末分化的成人组织,用于调节细胞分化_1J,这有 利于胚胎与胎儿组织的内稳和分化;另一方面Survivin 广泛表达于人类各种肿瘤组织,抑制了正常的细胞凋 亡_JJ.体内外研究表明,Survivin可在多种转化细胞 系中表达,并见于所有人类最常见的肿瘤组织,包括肝 癌,肺癌,结肠癌,胰腺癌,前列腺癌和乳腺癌_3;最近 的研究表明Survivin是通过与Smac分子的结合来抑制 正常的细胞凋亡,引发机体的癌变_4J. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1引物用于扩增编码人Survivin基因片段的引 物序列:引物1,5-cggaattcatgggtgccccgacgttg一3,其中划 线部分为引入的EcoRI位点;引物2,5一atggatcctcaatccat ggcagccag--3,其中划线部分为引入的BamHI位点.以 上引物均由上海生工生物工程公司合成. 1.1.2酶与试剂限制性内切酶购自NEB公司,T4 连接酶购自Promega公司,反转录酶及RNA抽提试剂 Trizol,均购自GibcoBRL公司;DEPC,PCR反应试剂, 凝胶DNA提取试剂盒,酵母抽提物及蛋白胨均购自上 收稿日期:2005—10-27修回日期:2006-01-25 电子信箱:fanmum@126.com 海生工生物工程公司;Anti--humanSurAntibody (NeoMarkerInc.)购自深圳晶美公司;LIPOFECTAMINE 2000脂质体转染试剂购自Invitrigen公司;辣根过氧化 物酶标记的RabbitantihumanIgG购自中国科学院上 海生化与华美生物公司;其他试剂均为国产分析纯. 1.1.3菌种,细胞株及质粒大肠杆菌DH5ct,表达载 体pBV220均为本所保存,L929细胞购自中国科学院 上海生化与细胞研究所. 1.2方法 1.2.1RT--PCR检测Survivin的表达切取新鲜组织 少许,加液氮研磨后以TRIZOL按说明书提取总RNA. 采用GIBCO的逆转录试剂盒以OligodT为引物进行逆 转录.以逆转录获得的cDNA为模板,用上述配对的特 异性引物进行PCR扩增目的条带.扩增条件为:97~C 30s,55℃30s,72~C1min;5个循环后PCR条件改为 97℃30s,72℃1min继续进行30个循环;72℃延伸 lOmin. 1.2.2Survivin表达载体的构建和鉴定胶回收上述 PCR条带,经测序正确后构建表达质粒pBV220一 Survivin,连接产物转化大肠杆菌DH5ot,LB(AmP)平皿 培养过夜.次日挑取若干生长克隆,接种含有Amp的 LB液体培养过夜提取质粒,分别用EcoRI,BamHI单 酶切以及EcoRI和BamHI双酶切鉴定. 1.2.3Survivin的诱导表达及制备(1)诱导表达. 挑取单克隆菌落接种于100ml含有50ug/mlAmp的 2006,26(5)廖玉华等:Survivin的表达和功能研究55 LB中,30℃震荡培养至OD6oo为0.6～0.8时置4~C冰 箱过夜.次日离心去上清,换用新鲜的培养液悬浮菌 体,按1:100稀释后继续扩增至OD6oo约为0.8左右, 42~C诱导5～6h.(2)蛋白的制备.将1L诱导表达菌 液离心收集菌体,用100ml裂解液(1mmol/LEDTA, lOmmol/LTris—HC1pH8.0)重悬菌体,均质机于500～ 700psi压强下,4min/次,破菌5次.10000r/min离心 15min,弃上清得包涵体,再用包涵体洗涤液(1%Triton X一100,50mmol/LTr