实验二外周血染色体制备20131120.pptVIP

　　在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素（phytohaemagglutinin, PHA），可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。 本方法在遗传病的诊断等方面广泛应用。 13. 制片 固定后，1000rpm离心10分钟，留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液 在冰水浸泡过的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（air drying）。 切记不要离火太近，以免烤焦玻拨片，影响后面的实验。 14. 染色（Giemsa staining） 用Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15. 镜检（microscopic examination） 在显微镜下寻找分裂相，并加以观察和分析。 * * 实验二 人类外周血染色体标本制备 一、实验目的 　熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。 　 初步掌握人类染色体标本制备的基本方法。 二、实验原理 三、实验步骤 1. 采血 、接种 2. 细胞培养（lymphocytes culture） RPMI1640培养液(含PHA)，37℃?0.5℃恒温中培养72小时。 3. 秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。 4. 离心 （centrifugation） 以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀，并用吸管打匀。 5. 低渗处理（hypotonic treatment） 加８毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打 匀使细胞 悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6. 预固定（pre-fixation） 低渗后，加新配的固定剂（甲醇︰冰醋酸=3︰1）１毫升，用滴管打匀。 7. 离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 8. 固定(fixation) 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 3︰1）5ml，将沉淀打匀，固定15分钟。 9.离心 1000rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀。 10. 固定： 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定15分钟。 11. 离心 1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。 12. 固定 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定15分钟。 制片方法 （冷片） 每组制 3-4片 四、试剂和药品 1、 培养液的配制