8个小麦wrky转录因子基因的克隆 表达及转录活性分析 word格式.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密?。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要WRKY是植物中一类最大的转录因子家族之一。WRKY转录因子的C末端有一个锌指结构，N端含有一个约由60 个氨基酸残基组成的WRKYGQK 结构域，WRKY 转录因子家族因这些结构特征而命名。研究表明，WRKY转录因子参与多种植物的生长发育、植物应激反应、生物胁迫和非生物胁迫等。但是，目前涉及小麦WRKY 基因的相关报道并不多，对小麦WRKY家族成员现阶段还缺少系统的鉴定、表达分析和功能研究。本研究在实验室前期有关小麦WRKY基因工作的基础上，首先在DFCI、NCBI 和Ensembl 数据库中搜索具有WRKY结构域的小麦EST 序列，通过序列拼接得到9 个新的WRKY基因的序列信息；进而以小麦的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法克隆得到9 个WRKY 新基因的cDNA 序列。我们将其分别命名为TaWRKY45-TaWRKY53。生物信息学结果显示，这9 个TaWRKY转录因子都含有保守的WRKY 结构域和锌指结构，它们分属于3个亚类：其中TaWRKY45属于第I亚类，TaWRKY48、TaWRKY51、TaWRKY52和TaWRKY53属于第II亚类，TaWRKY47、TaWRKY49和TaWRKY50属于第III亚类。虽然没有获得TaWRKY46基因全长序列，由于它含有一个保守的WRKY结构域和C2H2锌指结构，初步判断属于第I亚类或第II亚类。通过半定量RT-PCR技术检测了9 个TaWRKYs 基因在模式小麦品种中国春不同器官的表达模式以及在渗透胁迫（PEG处理）、高盐、极端温度等非生物逆境胁迫以及信号分子脱落酸ABA、赤霉素（GA）和H2O2 处理下的表达变化。发现不同的WRKY 基因在不同组织器官中的表达量有较大的差异，大部分基因（TaWRKY47、TaWRKY49、TaWRKY50、TaWRKY51、TaWRKY52)在根、茎和叶中表达量较高，而TaWRKY45、TaWRKY46和TaWRKY48在雄蕊和雌蕊中的表达较高。除了TaWRKY48 和TaWRKY53以外、其它的TaWRKYs都受NaCl诱导表达上调；所有的9个TaWRKYs基因都在一定程度上均受ABA胁迫诱导表达上调；4个基因(TaWRKY50、TaWRKY51、TaWRKY52 和TaWRKY53)受低温胁迫的诱导表达上调；4 个基因TaWRKY47、TaWRKY50、TaWRKY52、TaWRKY53 受GA诱导表达上调；TaWRKY52 受PEG诱导表达上调，TaWRKY53 受H2O2诱导表达下调。这些结果表明，小麦中这9 个TaWRKY基因都能够响应多种非生物胁迫及信号分子。我们通过酵母细胞的转录自激活实验对TaWRKY45、47-53 转录激活活性进行了检测。结果表明，TaWRKY47、TaWRKY50、TaWRKY51和TaWRKY52具有转录激活活性，其中TaWRKY50的转录激活功能较弱，而用这种实验方法未能检测到TaWRKY45、TaWRKY48、TaWRKY49和TaWRKY53的转录激活活性。进一步的分析结果表明，TaWRKY48、TaWRKY49、TaWRKY50、TaWRKY51 和TaWRKY53 都可以与典型的W-box 结合，其中TaWRKY50 与其结合的能力较弱。而TaWRKY47 和TaWRKY52 不与典型的W-box结合，但是可以结合突变的W-box，W-box碱基的突变可以使其它的结合活性降低或丧失。以上研究结果为进一步探索这些TaWRKYs在小麦生长发育过程中所参与的信号调节途径及其发挥的生物学功能提供了重要的线索。关键词：小麦；基因克隆；WRKY基因；表达分析；转录活性分析AbstractTheWRKYproteinsareoneofthelargesttranscriptionfactorfamilyinplants. WRKYproteinscomprisea