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酶促反应动力学 吉林大学基础医学院生化教研室 酶促反应动力学实验目的 酶促反应动力学 概念： 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素。 反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的量，常用初速度来衡量。 影响酶促反应速度的因素： 底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH值 抑制剂 激活剂 酶促反应动力学实验内容 底物浓度对酶促反应速度的影响 pH 对酶促反应速度的影响 抑制剂 对酶促反应速度的影响 竞争性抑制剂对酶促反应速度的影响 非竞争性抑制剂对酶促反应速度的影响 酶:碱性磷酸酶(AKP) 底物:磷酸苯二钠 Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。 抑制剂 概念： 凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为抑制剂 它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降 竞争性抑制作用 定义： 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 非竞争性抑制 定义： 抑制剂与底物的结构无关，结合在酶的活性中心以外的特定部位，使酶的活性降低。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用。 反竞争性抑制 定义： 抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。 竞争性抑制剂：Vmax不变 Km增大 非竞争性抑制：Vmax减小 Km不变 反竞争性抑制：Vmax减小 Km减小 实 验 结 果 的 处 理 1.以pH值为横坐标,OD值为纵坐标绘图,描述pH值对酶促反应速度影响，找出该酶的最适pH。 2.绘制底物浓度影响酶促反应的曲线，并求出Km值。 3.根据林－贝氏作图法 求出有抑制剂存在情况下的酶促反应的Km值，并判断本次实验为何种类型的抑制作用。 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 讨论 结论 酶：碱性磷酸酶 底物：磷酸苯二钠 通过实验得到[S]与V之间的关系曲线 获得Km值 [S] V 影响实验 Km S vo 1/S 1 vo 双倒数作图 直接作图 1 Vmax - 1 Km 1/2 Vmax[S] Km+[S] V = （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 1/V 1/[S] 1/Vmax - 1/Km Ｋm值与Ｖmax值的测定 抑制剂对酶促反应速度的影响 不可逆性抑制 可逆性抑制 ： 1、竞争性抑制 2、非竞争性抑制 3、反竞争性抑制 酶活性中心 共价 不能用透析超滤方法去除 非共价 反应模式 S S E E I I E E + P * 特点 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度； I与S结构类似，竞争酶的活性中心； 动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。 抑制剂↑ 无抑制剂 1/V 1/[S] （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 1/Vmax -1/Km S S E E E E + P S E S I I I I 反应模式 * 特点 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系； 抑制程度取决于抑制剂的浓度； 动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。 抑制剂↑ 1 / V 1/[S] 无抑制剂 （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax [S] Vmax 1/Vmax -1/Km 抑制剂↑ 1 / V 1/[S] 无抑制剂 抑制剂↑ 无抑制剂 1/V 1/[S] 竞争性抑制 非竞争性抑制 反应模式 E E E + P E I I S S S （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax /Vmax 1/[S] * 特点 1/Vmax 1/V 1/[S] 无抑制剂 抑制剂↑ -1/Km I与S分子结构不同,I只与ES结合； 动力学特点：Vmax表观Km都降低。 抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度； 底物浓度对酶促反应速度的影响 [操作步骤] 反 应 体 系 试剂(ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.04M基质液 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.8 1.0 --- pH10碳酸盐缓冲液 0.9