唐氏综合征无创性产前诊断及相关基因功能的研究-分子医学专业论文.docx

复旦大学博士学位论文差异最为显著——在早孕期胎盘组织中呈低甲基化状态，而在相应的孕妇外周血白细胞中则呈高度甲基化状态。为了排除克隆测序时的抽样误差，我们通过亚硫酸氢盐联合限制性内切酶分 析法，证实所有亚硫酸氢盐处理后DSCR4 PCR产物中两个位于酶切位点内的 CG位点确实存在如上所述的母胎甲基化差异。根据亚硫酸氢盐测序的结果，我们设计了DSCR4甲基化特异性PCR的引物， 通过甲基化特异性PCR，我们证实非甲基化的DSCR4(U．DSCR4)只存在于胎 盘组织中，针对U．DSCR4的引物扩增效果好，无引物二聚体，可用荧光染料法 (SYBR Green I)进行定量检测。相对定量分析显示，U-DSCR4只存在于早孕 期孕妇外周血血浆，而不存在于白细胞中，是位于2l号染色体上的胎儿表观遗 传学标志。DSCR4(Down syndrome critical region gene 4)是唐氏综合征关键区域内的 基因之一。DSCR4的mRNA只存在于胎盘组织和两种人绒癌细胞系(JEG3、 BeWo)中。唐氏综合征胎儿由于染色体异常，所有的器官包括胎盘同样可能受 到影响，特别是对合体滋养层的影响更大，导致胎盘产物生成异常，滋养层功能 下降，多个唐氏血清学筛查标志(PAPP-A、hCG等)即基于此原理。胎盘特异 性表达的DSCR4基因在唐氏胎盘滋养层异常的发生中的功能因而成为我们的研 究对象。甲基化特异性PCR证实DSCR4启动子区域在JEG3和BeWo细胞中低甲基 化，而在HEK293细胞中高甲基化，提示该基因的甲基化可能和基因表达有关。 为了研究DSCR4基因功能，我们原核表达了DSCR4全长蛋白质，作为抗原免 疫家兔制备DSCR4的抗血清并通过蛋白A／G beads进行亲和纯化。免疫印迹 (western blot，WB)证实纯化后的抗血清特异性显著改善。通过构建绿色荧光 蛋白DSCR4融合蛋白瞬时转染BeWo细胞，检测外源性DSCR4的亚细胞定位 以及用自制的抗体直接检测BeWo细胞内源性DSCR4的细胞分布，并通过分别 抽提BeWo和JEG3细胞的细胞核和细胞浆蛋白，用抗体进行WB都证实DSCR4 定位在滋养细胞核内。随后，我们合成3个针对DSCR4 mRNA的小干扰片段 (siRNA)，RT．PCR和WB证实2号小干扰片段对DSCR4的转录和翻译有明 显的干扰效果。下调DSCR4可以抑制细胞的迁移和侵袭，但不影响细胞增殖。第二部分唐氏综合征相关微小RNA——microRNA．125b相关功能的研究微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内长约l卜25个核苷酸的非编码小RNA。在细胞核内，编码miRNA的基因最初转录生成pri-miRNA，经过剪切生成60一100个碱基大小、具有发夹结构的单链RNA前体(pre-miRNA)，复旦大学博士学位论文然后被转入细胞质，在Dicer酶加工下形成miRNA成熟体，成熟体miRNA通过 与靶mRNA间的互补配对，导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而实现对靶基 因的负调控。唐氏综合征患者伴发白血病的比例较高，所以研究唐氏综合征相关miRNA 在肿瘤中的作用也成为我们关注的对象，又因为乳腺癌是本实验室的主要研究方 向之一，我们选择了乳腺癌为模型来研究唐氏综合征相关miRNA在肿瘤中的作 用。通过总RNA加尾后RT．PCR(poly A RT．PCR)分析了五个唐氏综合征相关 miRNA在乳腺癌细胞中的表达，我们发现mir-125b在高侵袭性乳腺癌细胞中高 表达，这提示它可能参与乳腺癌细胞的侵袭和转移。在mir-125b高表达的乳腺癌细胞中，下调mir-125b可以抑制细胞的侵袭转 移和增殖能力：相反，在低表达mir-125b的乳腺癌细胞中，上调mir-125b会增 强细胞的侵袭转移和增殖能力。我们通过裸鼠成瘤实验进一步确认下调mir-125b 可导致肺转移灶数目的减少。在寻找mir-125b的靶基因过程中，我们通过多种 方法证明mir-125b可作用于一系列的抑癌基因，它们包括BDPI、P53、BAPl、BAKl和STl8，这也进一步证明了mir-125b的癌基因活性，同时也发现mir-125b 主要作用于BDPI的转录水平，对BAKl的转录水平稍有影响，而对P53、BAPl 的转录水平影响不大。临床样本分析也显示，与良性乳腺纤维腺瘤和乳腺导管内 增生相比，恶性乳腺癌组织中mir-125b的表达量明显增高。这些结果证实 mir-125b在乳腺癌中发挥癌基因的活性。关键词：DSCR4，无创性产前诊断，唐氏综合征，DNA甲基化，mir．125b，乳腺癌，转移，BDPI。分类号：Q75。AbstractPart One Hypomethy’lated DSCR4 is placent