常见具毒力质粒沙门氏菌多重PCR检测引物的研究.pptVIP

常见具毒力质粒沙门氏菌多重PCR检测引物的研究 讲述内容： 1.研究目的和意义 2.实验设计 3.引物设计 4.实验验证 5.结论与展望 1.目的和意义 以沙门氏菌毒性质粒特异性基因序列为目标片段，结合生物信息学手段，对所选基因序列进行Blast同源性检索和ClustalW多重序列比对，选择各自保守区和特异区利用Primer Premier 5.0软件设计多重引物，检测常见的沙门氏菌。通过实际检验来不断改进和完善，有望开发出简便、快速、多重、定量的常见沙门氏菌检测试剂盒。将有助于人和动物沙门氏菌病的预防、早期临床诊断和食品、饲料、水源、畜舍等环境中沙门氏菌的跟踪监测，对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫具有重要的实际意义。 2.实验设计 2.1 研究方法 对常见沙门氏菌毒性质粒特异性基因 ，结合生物信息学手段，利用网络资源检索所选序列在沙门氏菌中的保守性，并以此为靶序列设计多重PCR引物，通过PCR检测标准菌株，对引物进行验证和筛选。 2.2 技术路线 检索基因——保守性检索——序列比对——特异性片段——设计引物——验证引物——优化PCR条件——病料检测——开发应用 2.3 技术疑难及解决方案 2.3.1 靶序列的筛选、引物的筛选 所选靶序列，是否为沙门氏菌高度保守的特异性序列，是本实验成败的关键。可通过网络数据库对其进行同源性检索，也可与其他常见细菌的基因组进行序列比对，找出沙门氏菌特异的保守序列。 2.3.2 引物检验 利用标准菌株、疑似菌株、混合菌株进行检验，利用文献中报道的引物来验证引物的特异性、敏感性、可重复性。 3.引物设计 3.1 参考文献中报道的组氨酸转运操纵子基因引物： S1：5’-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG -3’ 25bp Tm＝60℃ GC％=52％ S2：5’-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3’ 25bp Tm＝60℃ GC％=52％ S1/S2扩增片断大小为496bp 3.2 毒性质粒spvR基因设计引物： D1：5’-CATCGGGAATCGCTTGTC-3’ 18bp Tm＝56.6℃ GC％=55.6％ D2：5’-AATCCCAGAGCCCGACAG-3’ 18bp Tm＝57.7℃ GC％=61.1％ D1/D2对引物扩增片断大小302bp D3：5’-GAATGGCACTCTTATCCC-3’ 18bp Tm＝49.3℃ GC％=50.0％ D4：5’-GTCTCCCGTTTCTTGGTC-3’ 18bp Tm＝51.7℃ GC％=55.6％ D3/D4引物扩增片断大小672bp 上游引物： SF1：5’-TGTCTCCCGTTTCTTGGTCG-3’ 20bp Tm＝60.7℃ GC％=55.0％ SF2：5’-TGGTGTCTCCCGTTTCTTGG-3’ 20bp Tm＝60.5℃ GC％=55.0％ 下游引物： SR1：5’-ACTTCCACTCTTATCCCAACCG-3’ 22bp Tm＝60.0℃ GC％=50.0％ SR2：5’-CAAACAGGTTCCTTCAGTATCGC-3’ 23bp Tm＝60.8℃ GC％=48.0％ 经过筛选最终确定SF2/SR2对引物 3.3 各引物扩增片段长度 S1/S2： 496 bp SF2/SR2：789 bp D1/D2： 302 bp D3/D4： 672 bp 4.实验验证 4.1 标准菌株 4.1.1 沙门氏菌标准菌株 名称 拉丁名 编号 毒性质粒有无 群 H抗原血清种类 致病类型 备 注 肠炎S.enteritidis 2181 Spv D1 Hgm 人畜 A 阿柏丁S.aberdeen 2190 ——