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第 五 章 第 一 节 2.退火：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物与模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基的组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于含20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度的起点较为理想。引物的合适复性温度可通过以下公式帮助选择　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3.延伸：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用 温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一 般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够；3～4kb的 靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过 长会导致非特异性扩增带的出现。但是对低浓度模板的扩 增，延伸时间要稍长些。 ①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 ②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法，随机引物法，PCR标记法等，都能用于同位素和非同位素标记。 一、基本原理： 反义核酸技术是指人工合成或生物合成的DNA或RNA， 能与mRNA互补，是抑制与疾病发生相关的基因表达的一种 手段，它能封闭基因表达，具有特异性且操作简单，可用 于治疗由于基因突变或过度表达所致的肿瘤和遗传疾病。 其简单的原理是：根据碱基互补配对的原则设计出能 够与靶基因特异结合RNA或DNA序列，以其影响靶基因表达 ，抑制其功能。 根据核酸种类和作用方式的不同，反义技术主要分为 反义RNA、反义DNA、核酶（ribozyme）三类，其中以反义 RNA效率最高（反义物：靶为6：l），反义DNA次（60:1） ，而核酸需1000倍于靶分子的浓度才能完全抑制mRNA的转 录和加工。 1.反义RNA的作用机制：不完全明了。 ①反义RNA与靶基因结合而被核酸酶所降解。双链RNA对核酸酶的敏感性增加，易被降解； ②反义RNA可结合于靶基因5′mRNA非编码区包括SD序列，抑制mRNA与40s小亚基结合; ③可结合于靶基因5′mRNA编码区，主要是与起始密码子AUG结合，抑制翻译起始; ④ 可结合到mRNA上，影响它从细胞核到胞浆的转运; ⑤ 影响RNA生成和降解的一套程序; ⑥作用mRNA的5′端，阻止帽子结构的形成; ⑦ 作用mRNA的polyA形成位点，阻止mRNA的成熟及转运. 作用：复制水平：反义RNA与引物结合，抑制复制。 转录水平：反义RNA与mRNA 的5′端互补结合，阻止完整RNA转录。 2.反义RNA的制备与导入细胞 反义RNA的制备包括体内和体外两种 （1）体内合成：与一般基因工程方法相同。合成cDNA (2）体外合成：体外转录法：以DNA为模板合成RNA，合成的RNA导入细胞内；化学合成法：合成仪合成后，导入细胞。方法：显微注射、脂质体介导、电穿孔法和DNA-磷酸钙沉淀法。 （二）核酶 1982年Cech发现四膜虫rRNA前体有自我剪接作用， 证明了RNA有催化作用。提出了核酶的概念。 核酶是一类独特的RNA分子，具有自我剪切和催化功 能，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化 裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表 达. 1983年两位科学家Cech和Altman发现了核酶.鉴于切 赫在此领域作出的卓越贡献，因而获得1988年诺贝尔化学 奖。 人工合成具有催化活性的RNA片段（人工核酶），其 特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶 RNA，抑制基因表达，特别是有害基因的表达。核酶具有 序列特异性，不编码蛋白而无免疫性，又可重复利用等优 点。 3.核酶的作用 （1）核苷酸转移作用。