生化技术讲稿.pptVIP

一、盐析沉淀法 通过加入高浓度无机盐，使蛋白质和酶的溶解度降低，从而使之从溶液中沉淀析出的过程或现象称为盐析沉淀。 ① 破坏了蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质分子表面的疏水基团暴露，蛋白质分子通过疏水作用相互聚集而沉淀；② 无机盐中和了蛋白质分子表面的电荷，使蛋白质分子之间的电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。 机理： I logS 盐溶 盐析 0 0.15~0.2M logS = β- KsI Ks — 盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关。 Ks越大，盐析效果越好。 β — 与蛋白质种类及温度和pH有关的常数。 常用的无机盐：(NH4)2SO4，NaCl，Na2SO4 影响因素：无机盐的种类和浓度，温度，pH值 二、 等电点沉淀法 通过调节溶液的pH值，使其达到酶或蛋白质的等电点，从而使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为等电点沉淀。 等电点时，蛋白质分子所带的净电荷为零，蛋白质分子之间的同种电荷排斥作用消失，蛋白质分子的聚集作用增强。 机理： 注意： 调pH值，避免局部过酸或过碱，以防止酶变性或失活；只适用于疏水性较强的蛋白，亲水性很强的蛋白，单靠等电点不能使其完全沉淀。 特点： 操作简便，无需后续脱盐操作。 三、有机溶剂沉淀法 通过加入一定浓度的有机溶剂（乙醇、丙酮），使酶或蛋白质从溶液中沉淀析出的过程或现象称为有机溶剂沉淀法。 降低水溶液的介电常数，蛋白质分子之间的引力增加，蛋白质分子相互聚集而沉淀。 机理： 特点： 优点：有机溶剂密度较低，沉淀易于分离；沉淀物不需进行脱盐处理；有机溶剂易蒸发除去；沉淀物色泽较好。 缺点：有机溶剂容易导致蛋白质变性失活，且易燃易爆，故必须在低温条件下进行操作，且沉淀物应迅速与有机溶剂分离，以减少酶的变性失活率。 四、选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中的杂蛋白变性沉淀而目标蛋白不受影响的方法称为选择性变性沉淀法。 选择性变性方式：热变性，pH变性和有机溶剂变性 注意： 先充分了解目标蛋白的稳定性，严格控制条件，使杂蛋白变性沉淀的同时，目标蛋白不受影响。 五、其它沉淀方法 非离子性聚合物沉淀法： PEG 机理： 与有机溶剂相似 聚电解质沉淀法： 机理： 絮凝作用 第二章 层析分离 又称色谱分离，最早是由俄国植物学家1903分离植物色素时发明该技术。向填充有碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，然后用石油醚冲洗，发现柱中出现数条不同颜色相互分离的色带。这种分离技术（方法）由此被命名为色谱法。 层析分离技术的分辨率高，分离纯化效果好，可使样品达到较高的纯度，属于高度分离纯化技术。现在，根据各种原理进行的层析分离法不仅普遍应用于生物物质的定量分析与检测，而且已广泛应用于生物物质的纯化制备，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。 一、层析分离的基本原理 利用溶液中不同的溶质组分与固定相之间相互作用的不同，使得不同的溶质组分随流动相通过固定相时的移动速度不同，从而使不同的溶质组分得以相互分离的分离技术。 固定相：固定不动的相。可以是固体，也可以是液体。 流动相：可以流动的相。可以是液体、气体和超临界流体。 二、层析分离的分类 1. 流动相的相态分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析 2. 固定相的形状（式）分类 柱层析、纸层析、薄层层析 3. 操作压力分类 低压液相层析（ 0.5 MPa） 液相 柱层析 中压液相层析（0.5 ~ 4.0 MPa） 高压液相层析（4.0 ~ 40 MPa） 第二章 层 析 分 离 第一章 生物大分子的提取与沉淀分离技术 第三章 电 泳 分 离 第一章 生物大分子的提取与沉淀分离技术wcg71415@163.com 第一章 生物大分子的提取与沉淀分离技术 生物大分子是生物细胞通过新陈代谢所合成的具有特殊生物学功能的高分子化合物。主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。其中蛋白质（包括酶）和核酸是生命现象的基本体现者，是生命活动的物质基础。生物形态的多样性是由蛋白质分子的多样性所决定的，而生物物种的多样性则是由核酸分子的多样性所决定的。因此，对于生命活动现象本质的探索往往都是基于这两种生物大分子的研究。为了确切地研究生物大分子的组成、结构、功能以及各种特性，就必须得到高纯度