实验3－PCR基因扩增.ppt

实验三聚合酶链式反应（PCR）体外扩增DNA 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 二、实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)，模拟体内DNA复制过程，在体外快速扩增特定基因或DNA序列的一种技术，故又称为基因的体外扩增法。 以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3 ′端有引物存在的情况下，酶催化互补链的延伸，经变性、退火和延伸多次反复循环能使微量模板DNA大量扩增。产物DNA量按2n方式扩增。 理论上经30次的循环反应，DNA扩增倍数为106~109 PCR循环步骤 1.变性：加热使模版DNA双螺旋的氢键断裂，形成单 链DNA。 2.退火：降低温度，寡核苷酸引物与单链模板互补结 合，形成DNA模板-引物复合物。 3.延伸：从结合在DNA模板上的引物为出发点，在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，按 碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模 板DNA链互补的新链。 2、实验材料 1.DNA模板：E.Coli DH5α，含重组质粒 pET23a(+)+540bp 2.4种dNTP 3.引物 上游P1：5′-ATG GAC AAC AAC ATT CTC TAC TC -3′ 下游P2：5′-TTA CTT GGC GGT CAC TAA -3′ 4.Taq DNA聚合酶 5.10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 6. ddH2O 7.微量可调移液器，移液器取样吸头、PCR管(0.2mL) 四、操作方法 1、PCR扩增体系 —灭菌0.2mL PCR管中按下表加样 2、PCR反应程序 实验结果 实验报告 要求： 1、写出本实验目的、原理； 2、实验器材及实验步骤； 3、列出实验结果示意图并分析原因。 * * 3’ 5’ 5’ 3’ 高温变性 低温退火 中温延伸 不断循环 聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图 目的片段 模板 引物对 3’ 5’ 5’ 3’ (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 PCR的特点: 特异性高； 灵敏度高； 快速、简便； 无放射性； 既可扩增DNA也可扩增RNA。 引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：15—30bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 45-55%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间不应有互补链存在 3’端一定要与模板严格配对 5’端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：Primer 5，Oligo，DNAsis等 引物Tm：DNA分子一半为单链，另一半为双链时的温度称为该复 合体的溶解温度Tm，与G+C含量有关 反应体系 模板：DNA或RNA 引物：上游P1 和 下游P2 酶：耐热Taq DNA聚合酶 底物：dNTP Mixture PCR buffer： 10mmol/L Tris-HCl pH8.4(200C) 50mmol/L KCl Mg2+ 0.1mg/mL乙酰BSA 三、实验仪器与材料1、仪器： 基因扩增仪（PCR仪） 电泳仪 琼脂糖凝胶电泳槽 紫外检测器 微波炉 50.0 总体积 35.0 dd H2O