大鼠完全脊髓横断动物模型的建立及完整胚胎脊髓移植后GAP43 mRNA的表达.docVIP

大鼠完全脊髓横断动物模型的建立及完整胚胎脊髓移植后GAP43 mRNA的表达 【摘要】目的　探讨完整胚胎脊髓移植联合脑源性神经营养因子（BDNF）对脊髓完全横断损伤的修复作用。方法　将大鼠分为正常对照组，手术组A组（完全脊髓横断+完整胚胎脊髓移植）；B组（完全脊髓横断+完整胚胎脊髓移植+BDNF）。手术显微镜直视下切除大鼠脊髓3～4 mm，镜下观察确保完全离断，取同种孕13～14 d wistar大鼠完整胚胎脊髓同时移植。B组通过微型泵定时定量泵入BDNF溶液(2 mg/ml)。应用原位杂交方法于术后1～6 w计数各组脊髓损伤区神经生长相关蛋白(GAP43) mRNA神经元阳性细胞数。结果　术后3 w手术组开始恢复后肢运动功能，术后6 w出现协调踏步动作。B组3、4、5 w时阳性细胞数明显高于A组(P＜001)。结论　多个完整胚胎脊髓组织移植解决了脊髓完全离断情况下所需移植物总量较大的问题，联合应用BDNF，对脊髓损伤修复效果更为理想。 【关键词】 脊髓横断；完整胚胎脊髓　移植　BDNF　GAP43 mRNA 脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的神经系统创伤，而近年来研究表明采用胚胎脊髓移植修复脊髓损伤效果较为理想。另外，目前研究证实SCI动物模型很难保证脊髓横断的完全性，因此建立新型、有效的完全脊髓横断动物模型是脊髓损伤研究的关键。据此，本实验建立了改良的完全脊髓横断动物模型，并采取多个完整胚胎脊髓同时移植联合应用脑源性神经营养因子(BDNF)的治疗方法，通过原位杂交技术检测脊髓损伤区脊髓神经生长相关蛋白(GAP43) mRNA的表达，探讨完整胚胎脊髓移植对脊髓完全横断损伤的修复作用。 1　材料与方法 11动物 选择体重200～260 g的健康Wistar雌性大鼠。随机分成正常对照组(6只)，不经手术处理；手术组分为A组（36只）：完全脊髓横断+完整胚胎脊髓移植；B组（36只）：完全脊髓横断+完整胚胎脊髓移植+BDNF。实验过程中，动物模型出现死亡及时补充，并做标记，按照实验设计延时完成各项指标的评估。Wistar雌性大鼠及孕鼠由吉林大学实验动物中心提供。 12　仪器与试剂 DigcRNA探针、BDNF试剂由美国奥勒冈州生命科学学院刘红岩博士惠赠。2002型植入式胶囊渗透压泵微型泵，购自美国健康医疗仪器国际公司。 13　模型的建立 大鼠用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位，背部脱毛，无菌条件下以T8棘突为中心，在T6～T10水平切开皮肤，长约3 cm，紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌，直达椎板表面，用小乳突牵开器向两侧牵开椎旁肌，显露出T7～9的椎板和棘突。然后将大鼠固定于手术架上，咬骨钳咬除T7～9的棘突，在手术显微镜下用高速牙科钻沿上下椎间关节内侧纵向磨开T7～9的椎板，用显微镊小心移除椎板。在显露的脊髓的中间位置横向剪开硬脊膜和蛛网膜，将显微手术刀片尖端在显露出的脊髓背静脉和两侧脊髓背动脉之间分别横向切开软膜和脊髓实质，并于软膜下用眼科剪横断脊髓，用锋利虹膜刀片切除脊髓3～4 mm，镜下观察确保完全离断。脊髓缺损处无组织残留，切口处以外的软膜要保持完整。保留脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉。 14　胚胎脊髓移植方法 将同种怀孕13～14 d的大鼠麻醉，用无菌技术暴露妊娠子宫，由两侧子宫角逐个取出胚胎，选择胚体粉红、触及蠕动、无畸形的胎鼠做为脊髓移植供体。在显微镜下取出完整胚胎脊髓组织，尽可能除去其表面软脊膜等结缔组织。将完整胚胎脊髓植入大鼠脊髓离断处，通常需要3～4个完整胚胎脊髓，以确保离断处被移植物完全填充。 15 　给药方法 B组在脊髓移植后将植入的BDNF微型泵导管留置于移植脊髓组织旁，微型泵泵入BDNF溶液(2 mg/ml)，05 mu;l/h，持续2 w。A组、B组术后8 h内肌注甲基强的松龙4 mg，术后3d行青霉素（5万U/kg）肌注，每日一次，口服呋喃坦啶水溶液(500 g/L)预防感染。采取防止脱水措施，人工控制大鼠膀胱排尿，每日早晚各1次。隔日悬吊鼠尾20～30 min，以减轻截瘫后肢的受压及皮肤擦伤。在鼠笼地面放置食物，经口进食，喝水便利，注意补充高能量食物。 16 　原位杂交试验 GAP43引物序列为5prime;GCAGGACGAGGGTAAAGA3prime;，R5prime;CACGCACCAGATCAAATAA3prime;；用地高辛标记GAP43 cDNA探针。各实验组分别于术后1、2、3、4、5、6 w随机抽取存活的大鼠6只，取损伤部位及其头尾侧各3个节段的脊髓切片，进行原位杂交实验。经计算机图像分析系统处理，分别测出平均每张切片每平方毫米神经元阳性细胞数。 17　统计学处理 数据以x±