集胞藻pcc6803中基因slr1393的分析-analysis of slr 1393 gene in polycystis pcc 6803.docx

第 1 章 文献综述1.1 蓝藻概述蓝藻又称蓝细菌（cyanobacteria），是一类界于低等细菌与高等植物之间能与 植物一样进行产氧光合作用的原核生物。它们是地球上最早出现的光合自养生 物，广泛分布于地球上各种类型的水环境和一些陆生环境，是海洋和内陆水体中 最重要的原初生产者之一[1]。光合作用是地球上最重要的化学反应，光合生物通 过光合作用提供地球上所有生命活动能量来源。70%以上的地球表面由海洋和淡 水覆盖，浮游藻类是海洋和内陆水体中最重要的初级生产者，为整个水域生态系 统的食物网提供能量来源。全球藻类的生产力约占全球总植物生产力的 45%。在 全球尺度上，藻类光合作用对于维持地球生态系统的正常运转起着关键作用，藻 类光合作用测定与光合产量计算是当今全球变化主题中海洋碳通量研究的核心。 藻类，特别是单细胞的浮游藻类，是光合作用研究中最重要的模式生物。蓝藻其藻体分为单细胞体、丝状体和群体等。蓝藻约有 150 属，2000 种[2]， 传统上分为色球藻目（ Chroococcales ）、颤藻目（ Osillatoriales ）、念珠藻目 （Nostocales）、真枝藻目（Stigonematales）等。近年来借鉴其他微生物研究模式 而建立的包括基因系统“敲除”、转录组学、蛋白组学和生物信息学等功能基因组 学研究方法，使得蓝藻分子遗传学已经能够着眼于整个基因调控网络的研究，跨 入了基因组和后基因组学时代。在 90 年代中后期，一些蓝藻全基因组序列的完 成，加速了蓝藻分子生物学的研究。其中集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）全 基因组序列于 1996 年公布（http://www/http://www. kazusa. orjp/ cyanobase/ Synechocystis）， 它是单细胞种类，具有天然的 DNA 转化系统，是光合作用分子生物学研究的重 要模式生物。藻类光合作用的研究有着十分重要的重要，对光合作用及相关科学问题的认 识不仅为基础生物学研究提供了平台，它也是微藻生物技术开发应用的基础。 1.1.1 蓝藻外源基因的转化系统蓝藻分子遗传学研究的前提条件之一是建立蓝藻遗传转移系统。用于蓝藻基因转移系统主要分为两类：一类是遗传转化，包括天然转化，诱导转化和电击转化：另一类是接合转移。普遍而有效的蓝藻外源基因的转化方法是利用外源 DNA 通过同源双交换整合到蓝藻染色体上，这样便于通过随机或定向插入诱变改变蓝 藻基因组，而获得各种类型的突变株。自然转化自然转化是指在对数生长期的蓝藻细胞不经任何处理而直接吸收外源 DNA 的基因转移系统。一些单细胞蓝藻，如集胞藻 PCC 6803 和聚球藻 PCC 7002、PCC 7942 等，不需要诱导成感受态，即具有自然吸收外源 DNA 的能力[46]。目前用于 自然转化的蓝藻绝大多数属于聚球藻（Synechococcus）和集胞藻（Synechocystis） 这两个属的单细胞蓝藻，然而目前为止其详细转化机制还不太清楚。电击转化电击转化是利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间可逆穿孔，使外源游离 DNA 穿过细胞膜转移进细胞的方法。电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程 序，几乎所有的细菌都可以找到一套与之相适应的电穿孔操作条件。具体操作程 序因转化细胞的种属不同而不同。Ca2+诱导转化几乎不能转化大于 100kb 的质粒 DNA，所以电击转化比 Ca2+诱导转化方法更为理想，对于蓝细菌来说，特别是 链状蓝细菌，电击转化可获得较为理想的转化效率。自从 1989 年 Thiel 等首次通 过电击转化成功地把穿梭表达载体 pRL6 转入鱼腥藻 M131 以来，已有一批穿梭 表达质粒通过电击在多种蓝藻中转化成功[3]。诱导转化诱导转化是人工诱导感受态转化外源DNA的基因转移系统。有些蓝藻难以 进行外源DNA的自然转化，因而人们探索了新的转化系统，通过CaCl2或溶菌酶 处理细胞再转化。如1995年闵红涛等[4]利用溶菌酶处理人工诱导聚球藻PCC 6301细胞的感受态，将外源质粒pBR325转化受体细胞并表达抗性，转化频率约5 ×10-4个转化子/细胞。另外也可通过Ca2+诱导细胞感受态，或利用溶菌酶EDTA处理细 胞产生原生质体进行转化。1983年，Hanahan除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外， 还设计了一套用二甲基亚砜(DMSO)和二巯基苏糖醇(DTT)进一步诱导细胞产生 高频感受态的方法，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率[5]。目前，Ca2+诱导法已成功用于葡萄球菌、大肠杆菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。虽然用CaCl2处理受体细胞可增加细胞透性，但对链状蓝细菌进行转化成功率还较低，且重复 性差。接合转移接合转移，即现已普遍使用的三亲本杂交法(