可溶性i-soluble i.docxVIP

英文缩略词表EAE：experimental autoimmune encephalomyelitis 实验性自身免疫性脑脊髓炎 BSA: bovine serum albumin 牛血清白蛋白 ELISA: enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 FBS：Fetal Bovine Serum 胎牛血清SDS: sodiumdodecyl sulfate -polyacrylamide gelelectrophoresis变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳OPD: ortho-phenylenediamine dihydrochloride 邻苯二胺HRP: horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶PBS：Phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液PMHC:peptide/MHC complex 抗原肽/MHC 复合物IXC：Ion Exchange Column| 离子交换柱SPA:Staphylococcal Protein A 葡萄球菌 A 蛋白 MHC：major histoxompatiblity comple 主要组织相容性复合体 FACS: Fluorescence Activating Cell Sorter 流式细胞术 DAB:dimethylamino azobenzene 二甲氨偶氮苯 MOG:myelin oligodendrocyte glycoprotein 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 MS:multiple sclerosis 多发性硬化TMB：tetramethyl benzidine 四甲基联苯胺OD：optical density 吸光度MBP：myelin basic protein 碱性髓鞘蛋白HLA：human leukocyte antigen 人类白细胞抗原CNS：central nervous system 中枢神经系统 PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 EBV：Epstein- Barr virus EB 病毒CSF：Cerebrospinal fluid 脑脊液Th2：helper T cell type 2 辅助 T 细胞 2 型IL-2：interleukin-2 白介素 2可溶性 I-Ab/Fc 二聚体的优化表达及纯化硕士研究生：许哲指导教师：吴雄文教授中文摘要主要组织相容性复合体(MHC)是脊椎动物体内某一染色体上的一组紧密连 锁的具有高度多态性的基因群。根据结构和功能的不同，MHC 的基因产物可分 为两种类型，即 MHCⅠ类和 MHCⅡ类分子。MHCⅡ类分子是呈现免疫系统的 特定细胞表面的由 A 链和 B 链非共价键结合组成的一组具有高度多态性的跨膜 糖蛋白[1]。近期发现，可溶性的 MHCⅡ类分子（尤其是多聚形式存在的可溶性 pMHC，例如以二聚体形式）通过和表位特异性 T 细胞的结合，可以发挥免疫调 节的作用，其机制是：①封闭了特异性 TCR；②可溶性 PMHC 与 TCR 结合只能 提供 T 细胞激活的第一信号，但是缺乏第二信号，这样会引起 T 细胞的失能和 克隆清除，因而能够抑制 T 细胞对抗原的应答。前期，我们实验室利用抗原肽 MOG35-55 诱发了 C57BL/6 小鼠的 EAE 模 型，T 细胞的识别表位比较明确，这些表位可以诱导自身反应性 CD4+T 细胞应 答，造成免疫损伤。实验室已经构建出了与上述 CD4+T 细胞特异性结合可溶性pMHC（MOG35-55-I-Ab/Fc）二聚体，作用于 EAE 小鼠模型的体内外干预实验， 以期能够缓解小鼠 EAE 模型的发病症状。然而，之前制备的几种 I-Ab/Fc 二聚体存在着表达产量和生物学活性均较低的问题，并且存在着纯化条件不够成熟， 只用 PEG 浓缩纯化不太完全，用于 EAE 小鼠干预实验，对于进一步探索治疗 EAE 发病小鼠的发病机制和治疗效果均产生不利影响。因此，为了筛选出 I-Ab/Fc二聚体的较高表达产量和优化纯化条件，以期达到理想的预期结果。本实验研究 的主要内容及结果如下:1 含昆虫信号肽（gp-67 信号肽）基因序列的真核表达载体的构建。利用信号肽来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间, 提高可溶性, 可避免 因包涵体复性带来的困难[2]。在原核表达系统里，如乳酸杆菌，大肠杆菌等都 得到了表达和分泌；信号肽也广泛地应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状 病毒表达系统中[3]。为了提高 I-Ab 二聚体的蛋白表达分泌水平，我们将先前制 备好的含有目的基因片断通过用含昆虫信号肽的引物用重叠 PCR 技术，再利用 酶切和连接，